Wirkung von Cholesterin auf die Struktur einer Phospholipid-Doppelschicht

Schlüsselwörter:

• Biomembran
• molekulare Simulation
• Phasenverhalten
• Dimyristoylphosphatidylcholin
• mesoskopisches Modell

In diesem Artikel befassen wir uns mit einer scheinbar einfachen thermodynamischen Frage: Wie verändert sich die Fläche pro Molekül einer Phospholipidmembran, wenn wir Cholesterin hinzufügen? Diese Frage wurde erstmals 1925 von Leathes (1) gestellt und wird bis heute diskutiert. Die Bedeutung dieser Frage bezieht sich direkt auf die Bedeutung von Cholesterin für die Funktion von Membranen höherer Eukaryoten. Zum Beispiel reguliert Cholesterin die Fluidität der Membran und moduliert die Funktion von Membranproteinen (2). Das Verständnis dieser Mechanismen hat viele Forscher motiviert, die Lipid-Cholesterin-Wechselwirkungen im Detail zu untersuchen. Da eine Membran als 2D-Flüssigkeit angesehen werden kann, wäre eine erste Schätzung, wie sich die Fläche pro Molekül bei der Zugabe von Cholesterin ändern würde, eine ideale Vermischung anzunehmen, wobei die Fläche pro Molekül einfach ein gewichteter Durchschnitt der Reinkomponentenflächen ist. 1925 zeigte Leathes, dass man anstelle einer idealen Vermischung ein auffallendes nichtideales Verhalten beobachtet (1). Dieses nichtideale Verhalten wird als Kondensationseffekt (3) bezeichnet, da die Fläche pro Molekül im Vergleich zur idealen Vermischung viel geringer ist. Da sich eine Membran wie eine inkompressible Flüssigkeit verhält, führt eine Abnahme der Fläche pro Molekül zu einer entsprechenden signifikanten Zunahme der Gesamtdicke der Doppelschicht. Eine solche Zunahme der Dicke signalisiert eine Reorganisation der Struktur der Membran. Da Veränderungen in der Struktur der Membran wichtige Konsequenzen für die Funktion von Proteinen haben können (2), ist es wichtig, ein besseres molekulares Verständnis der Cholesterin-induzierten Veränderungen zu haben.

Es wurden verschiedene konzeptionelle Modelle vorgeschlagen, um die nichtidealen Cholesterin–Lipid-Wechselwirkungen zu erklären. Beispiele hierfür sind das Modell der kondensierten Komplexe (4, 5), das Supergittice-Modell (6) und das Umbrella-Modell (7). Das Modell der kondensierten Komplexe erklärt den Kondensationseffekt, indem angenommen wird, dass Cholesterin die reversible Bildung eines stöchiometrischen Cholesterin–Lipid-Komplexes induziert. In einem solchen Komplex wird die Membran kondensiert, da die Lipid-Acylketten geordneter sind. Bei einer gegebenen Cholesterinkonzentration besteht eine Gleichgewichtszusammensetzung zwischen diesen kondensierten Cholesterin–Lipid-Komplexen und gewöhnlichen Lipiden. Das Übergittermodell geht davon aus, dass die Cholesterinmoleküle bei kritischen Konzentrationen eine bestimmte weiträumige Ordnung aufweisen. Das Schirmmodell geht davon aus, dass der hydrophile Teil des Cholesterins zu klein ist und daher die Lipide zum Screening der Cholesterinmoleküle vor hydrophoben Wechselwirkungen mit Wasser beitragen müssen. Die Phospholipide können diesen Schirm nur erzeugen, wenn sich diese Moleküle aufrichten, um Platz für Cholesterin zu schaffen. In diesen Modellen sind die zugrunde liegenden Mechanismen, die zur Kondensation führen, sehr unterschiedlich. Interessanterweise kam eine kürzlich durchgeführte experimentelle Studie zu dem Schluss, dass ihre Daten das Modell der kondensierten Komplexe unterstützten (8), während eine andere Reihe von Experimenten keinen Hinweis auf die kondensierten Komplexe fand und das Umbrella-Modell unterstützte (9). Diese Unterschiede in den Erkenntnissen motivierten uns, ein mesoskopisches Modell eines Lipid–Cholesterin–Wasser-Systems zu entwickeln. Wir verwendeten molekulare Simulationen, um etwas Licht auf die laterale Organisation von Cholesterin in Lipidmembranen und die zugrunde liegenden Lipid–Cholesterin-Wechselwirkungen zu werfen, die den Kondensationseffekt induzieren.

Mehrere molekulare Simulationen von Allatom- und grobkörnigen Modellen von Cholesterin in Lipiddoppelschichten wurden in der Literatur berichtet (für einige neuere Beispiele siehe refs. 10-13 und Referenzen darin). Idealerweise möchte man All-Atom-Simulationen verwenden, um den Kondensationseffekt über einen großen Bereich von Temperaturen und Zusammensetzungen zu untersuchen. Derzeit sind diese Simulationen jedoch zu zeitaufwendig. Daher verwenden wir ein grobkörniges Modell, bei dem die Effizienz durch die Integration einiger Details eines Vollatommodells erzielt wird. Unser Modell basiert auf dem Modell von Kranenburg und Mitarbeitern (14, 15). Das Modell verwendet explizite Wassermoleküle. Lipide und Cholesterin bestehen aus hydrophilen und hydrophoben Partikeln (siehe Abb. 1). Dieses Modell Klumpen Gruppen von Atomen in einem mesoskopischen Pseudoatom. Die intramolekularen Wechselwirkungen umfassen Bindungsvibrationen und Bindungsbiegung, deren Parameter optimiert wurden, um die Struktur eines einzelnen Phosphatidylcholinmoleküls mit allen Atomen in Wasser nachzuahmen. Die hydrophilen und hydrophoben Wechselwirkungen werden mit weichabstoßenden Wechselwirkungen beschrieben, und die Parameter dieser Wechselwirkungen werden mit den Löslichkeitsparametern in Beziehung gesetzt, indem die von Groot und Rabone (16) beschriebene Methode verwendet wird. Die Idee dieses Modells ist, dass die Hauptantriebskräfte der Cholesterin–Phospholipid-Vermischung die hydrophoben und die hydrophilen Wechselwirkungen sind, was die Schlussfolgerung vieler experimenteller Studien ist (7, 9, 17). In unserem Modell steht die Längeneinheit in direktem Zusammenhang mit der effektiven Größe eines Pseudoatoms, d. H. Ein Pseudoatom nimmt ein Volumen von 90 Å3 ein. Die Energieeinheit ergibt sich aus der Anpassung der weichen Abstoßungsparameter der mesoskopischen Wasserpartikel an die Kompressibilität von Wasser unter Umgebungsbedingungen. Die Einfachheit der Modelle erfordert eine Neuparametrierung dieser weichen Abstoßungen, wenn die Temperatur geändert wird. In dieser Arbeit gehen wir jedoch davon aus, dass die Parameter temperaturunabhängig sind. Die Temperaturskala wird durch Anpassung an die experimentellen Phasenübergangstemperaturen eingestellt. Weitere Details und Anwendungen dieses Modells finden Sie in Ref. 18.

Unser Modell des Cholesterins, in Abb. 1B basiert auf den gleichen Annahmen über die effektive Größe und Wechselwirkungen wie das Lipidmodell. Nach McMullen et al. (19) haben wir den hydrophoben Teil des Cholesterinmodells etwas länger gemacht als den hydrophoben Teil des Lipidmodells, das Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) darstellen soll. Der Einfachheit halber haben wir angenommen, dass die hydrophoben und hydrophilen Wechselwirkungen eines Cholesterinmoleküls denen in einem Lipid ähnlich sind. Um einen Einblick in den molekularen Mechanismus der kondensierenden Wirkung von Cholesterin zu erhalten, haben wir drei cholesterinähnliche Moleküle eingeführt, bei denen wir das hydrophob-hydrophile Gleichgewicht des Moleküls stören: Eines, bei dem wir die hydrophobe Schwanzlänge verringern (siehe Abb. 1C), in dem wir eine zusätzliche hydrophobe Gruppe hinzufügen (Abb. 1D), und eine, in der wir den Ring durch eine einfache Kette ersetzen (Abb. 1E).

Abb. 2 zeigt das berechnete Temperatur- und Phasendiagramm des Wasser-Phospholipid-Cholesterin-Systems. Die Phasengrenzen wurden aus einer visuellen Inspektion der Schnappschüsse und quantitativer aus den Wendepunkten der Kurven erhalten, die die Fläche pro Lipid, die durchschnittliche hydrophobe Dicke der Membran und die Schwanzordnungs- und Neigungsparameter angeben. Diese Eigenschaften wurden als Funktion von Temperatur und Cholesteringehalt berechnet.

Konzentrieren wir uns zunächst auf die reinen Lipidphasen, und die Wirkung von Cholesterin wird als nächstes diskutiert. Für die reine Lipiddoppelschicht wurde das Phasendiagramm von Kranenburg und Smit (14) für ein viermal kleineres System berechnet. Wir verwendeten die gleiche Methodik, um die Phasengrenzen zu lokalisieren wie Kranenburg und Smit (14). Unsere Ergebnisse stimmen hervorragend mit dieser Studie überein, was darauf hindeutet, dass die Effekte endlicher Größe gering sind. Für das reine Phospholipid beobachten wir bei hohen Temperaturen eine flüssige Phase (La), in der die Schwänze ungeordnet sind. Bei niedrigen Temperaturen werden die Schwänze geordnet und gekippt, was die Gelphase (L’c) definiert. Diese beiden Phasen sind durch die geriffelte Phase (P’β) getrennt, in der wir eine Mikrophasentrennung von Domänen beobachten, in denen die Doppelschicht dick und die Lipide geordnet sind, und Domänen, in denen die Doppelschicht dünn und die Lipide ungeordnet sind. Das Vorhandensein dieser drei Phasen zeigt, dass das resultierende Phasendiagramm in sehr guter Übereinstimmung mit dem experimentellen Diagramm des reinen Lipids (20) ist. Die Temperaturskala wird eingestellt, indem die Temperaturen der Phasenübergänge der Gelphase zur Rippelphase (Tp) und der Rippelphase zur Flüssigphase (Tm) mit den entsprechenden experimentellen Phasenübergangstemperaturen von reinem DMPC abgeglichen werden. Ein weiterer Vergleich mit den experimentellen Daten erfolgt für die mittlere Fläche pro Molekül der Doppelschicht (Fig. 3A), für die Doppelschichtdicke (Fig. 4A) und für die Lipidschwanzordnung (Fig. 4B). Für die Fläche pro Lipid erhalten wir 56 Å2 pro Molekül im Vergleich zu den experimentellen (21) 60 Å2 pro Molekül. Für die Doppelschichtdicke berechneten wir einen Wert von 38,7 Å, was gut mit dem experimentellen Wert von 36 Å (21) vergleichbar ist, und eine ähnliche Übereinstimmung wird für die Schwanzreihenfolge erhalten (siehe Abb. 4B). Um die Fläche pro Molekül für reines Cholesterin zu berechnen, simulierten wir eine Doppelschicht aus reinem Cholesterin. Wir erhielten einen Wert von 40,3 Å, was sehr gut mit dem jüngsten experimentellen Wert von 41 Å (22) für eine Monoschicht von Cholesterin verglichen werden kann. In Anbetracht der Näherungen in unserem Modell ist die Übereinstimmung zwischen den experimentellen und den simulierten Werten überraschend gut.

Wenden wir uns nun der Wirkung von Cholesterin auf die Eigenschaften der Doppelschicht zu. Die erste Frage, die wir beantworten werden, ist, ob unser Modell den Kondensationseffekt reproduzieren kann. Abb. 3A zeigt die Wirkung von Cholesterin auf die Fläche pro Molekül in Abhängigkeit von der Cholesterinkonzentration. Der Vergleich mit den experimentellen Daten zeigt erneut eine sehr gute Übereinstimmung. In dieser Abbildung zeigen wir auch die Fläche pro Molekül unter der Annahme einer idealen Vermischung. Diese Zahl veranschaulicht überzeugend den Kondensationseffekt; die Fläche pro Molekül nimmt viel stärker ab, als man aufgrund idealer Vermischung erwarten würde. Andere experimentelle Daten umfassen die Wirkung von Cholesterin auf die Doppelschichtschwellung (Abb. 4A) und der Parameter tail Order (Fig. 4B). Sowohl die experimentellen Daten als auch die Simulation zeigen, dass Cholesterin die Dicke der Doppelschicht und ihre Ordnung erhöht. Auch für diese beiden Eigenschaften stimmen unsere Simulationsergebnisse sehr gut mit den experimentellen Daten überein. Die Simulations- und Versuchsdaten (Fig. 3A und 4A und B) zeigen, dass die Zugabe von Cholesterin die Eigenschaften der Lipiddoppelschicht bis zu ±30 Mol-% Cholesterin stark modifiziert. Danach wird eine Region erreicht, in der eine weitere Zugabe von Cholesterin nur eine geringe Wirkung hat. Bei 30 Mol-% Cholesterin haben sowohl die Fläche pro Molekül als auch die Lipidschwanzordnungs- und Neigungsparameter für die Gelphase typische Werte.

Die Farbcodierung in Fig. 2 zeigt die Differenz zwischen der simulierten Fläche pro Lipid und dem durch die Annahme einer idealen Vermischung geschätzten Wert. Wir beobachten, dass bei hohen und niedrigen Temperaturen der Kondensationseffekt relativ gering ist. Der Kondensationseffekt ist in einem wohldefinierten Bereich im Phasenraum maximal, der knapp über dem Hauptphasenübergang des reinen Phospholipids liegt. Um die Art des Kondensationseffekts besser zu verstehen, ist es wichtig, die Wirkung der Zugabe von Cholesterin auf das Phasenverhalten der Membran zu verstehen.

Abb. 2 zeigt die wichtigsten Merkmale des Phasendiagramms. Die verschiedenen Phasen, die wir in unseren Simulationen beobachteten, wurden auch experimentell beobachtet, wenn auch nicht immer für die spezifische Mischung von DMPC und Cholesterin (20, 23, 24). Die verschiedenen experimentellen Studien zeigen jedoch qualitativ sehr unterschiedliche Phasendiagramme, was unsere Möglichkeiten für einen detaillierten Vergleich einschränkt. Momentaufnahmen der verschiedenen Phasen sind in Abb. 5.

Bei sehr hohen Temperaturen hat die Zugabe von bis zu 50 mol% Cholesterin wenig Einfluss auf die Struktur der Membran, und wir beobachten die La-Phase für alle Konzentrationen (24). Bei Temperaturen unter Tp beobachten wir, dass Cholesterin die Struktur der Gelphase verändert, indem es die Neigung der Lipidschwänze hemmt und die Bildung der L’c-Phase verursacht (20) (vergleiche Abb. 5D mit E). Bei höheren Cholesterinkonzentrationen (>20%) beobachten wir die Bildung kleiner, cholesterinreicher Cluster. Wir bezeichnen diese Phase mit LII, und diese Phase ist in Abb. 5E. Bei Temperaturen zwischen Tp und Tm befindet sich die reine Doppelschicht in der Welligkeitsphase, und Cholesterin transformiert diese Welligkeitsphase (siehe Abb. 5C) in eine flüssig geordnete Phase (23) (Fig. 5B). Der Begriff flüssig geordnete Phase wurde von Ipsen et al. (25). Die Dicke der Doppelschicht liegt zwischen der Dicke der flüssigen und der Gelphase. Die Lipid-Schwanzordnungsparameter haben Werte, die nahe an der Gelphase liegen; Im Gegensatz zur Gelphase sind die Lipide jedoch ungeordneter und kippen nicht. Cholesterin erhöht allmählich die Temperatur, bei der der La-Lo-Phasenübergang auftritt. Bei sehr hohen Cholesterinkonzentrationen wandelt sich die flüssig geordnete Phase in eine Gelphase (LII) um, wenn die Temperatur unter Tm gesenkt wird. Diese Phase wurde experimentell für Dipalmitoylphosphatidylcholin beobachtet (26), aber wir haben keine experimentellen Daten für DMPC unter diesen Bedingungen gefunden. Kehren wir nun zum Kondensationseffekt zurück. Abb. 2 zeigt, dass der Kondensationseffekt bei einer Temperatur knapp oberhalb des Hauptübergangs Tm maximal ist. Der Grund dafür ist, dass sich die reine Doppelschicht unter diesen Bedingungen in einem flüssig-ungeordneten Zustand befindet, während die Zugabe von Cholesterin zur Doppelschicht es in eine flüssig-geordnete Phase umwandelt, die eine Fläche pro Lipid aufweist, die im Vergleich zum flüssig-ungeordneten Zustand viel kleiner ist. Dieser große Unterschied verursacht einen großen Kondensationseffekt. Bei höheren Temperaturen bleibt die flüssige Phase für alle Cholesterinkonzentrationen stabil, was zu einem viel geringeren Kondensationseffekt führt. Bei niedrigeren Temperaturen hat die reine Lipiddoppelschicht eine Fläche pro Lipid, die viel näher an der Fläche pro Lipid der flüssig geordneten Phase liegt, und infolgedessen ist der Kondensationseffekt weit geringer.

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass der Kondensationseffekt eine direkte Folge bestimmter Änderungen im Phasenverhalten ist, die Cholesterin induziert. In der Literatur gibt es verschiedene Spekulationen über jene Aspekte der Cholesterinstruktur, die speziell für ihre kondensierende Wirkung verantwortlich sind. Zum Beispiel basiert das Schirmmodell auf der Vorstellung, dass der hydrophile Teil des Cholesterins im Vergleich zu Phospholipiden viel kleiner ist und das Phospholipid als Regenschirm für zusätzliches Screening vor Wechselwirkungen mit Wasser benötigt. Dies deutet darauf hin, dass eine zusätzliche hydrophile Gruppe die Eigenschaften vollständig verändern würde. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die sperrige Ringstruktur; wenn wir den Ring durch einen Schwanz ersetzen, erhalten wir ein Molekül, das eher einem Alkoholmolekül ähnelt (27). Eine Verkürzung des hydrophoben Schwanzes hätte jedoch wenig Wirkung. Abb. 1 zeigt die modifizierten Cholesterinmoleküle, die diese Veränderungen nachahmen. Tatsächlich sind die Ergebnisse in Fig. 3B zeigen, dass die Verkürzung des Schwanzes von Cholesterin den gleichen Kondensationseffekt zeigt. In Fig. 3B zeigt, dass für beide anderen Modifikationen des Cholesterinmoleküls, Hinzufügen einer zusätzlichen hydrophilen Gruppe und Ersetzen des Rings durch eine lineare Kette, kein kondensierender Effekt beobachtet wird. Wir beobachten den gegenteiligen Effekt: die Zugabe dieser Moleküle bewirkt, dass sich die Doppelschicht im Vergleich zur idealen Vermischung ausdehnt. Die Wirkung von (kleineren) Alkoholen auf die Fläche pro Molekül wurde experimentell gemessen, und die experimentellen Daten zeigen auch eine Zunahme (28). In engem Zusammenhang damit beobachteten wir, dass für beide Fälle im Phasendiagramm die Flüssigphase über den gesamten Konzentrationsbereich stabil war. Tatsächlich beobachten wir, dass die Zugabe dieser Moleküle die Hauptübergangstemperatur verringert, und daher gibt es keinen Bereich im Phasendiagramm, in dem ein großer Kondensationseffekt auftritt.Simulationen mit diesen strukturellen Variationen von Cholesterin zeigen, wie überraschend subtil der Mechanismus ist. Der Hauptübergang in einer reinen Doppelschicht ist sehr empfindlich gegenüber den hydrophoben Wechselwirkungen. Die Hauptgruppen der Lipide schirmen die hydrophoben Schwänze vom Wasser ab. Bei hohen Temperaturen ist die Fläche pro Lipid hoch, und dieses Screening ist alles andere als optimal; Aber unter diesen Bedingungen dominiert die Kettenentropie. Das Absenken der Temperatur macht es immer wichtiger, die hydrophoben Wechselwirkungen abzuschirmen, und induziert am Hauptübergang schließlich eine Ordnung der Ketten. Ein wichtiger Aspekt ist zu verstehen, wie Cholesterin die flüssige Phase destabilisiert. Cholesterin hat einen kleineren hydrophilen Kopf und ist daher weniger effizient bei der Abschirmung der hydrophoben Wechselwirkungen. Bei hohen Temperaturen kann die Lipiddoppelschicht dies aufnehmen, aber bei niedrigeren Temperaturen können die Lipide nur zum Screening des Cholesterins beitragen, indem sie seine Fläche pro Lipid verringern. Dies verursacht die beobachtete Reihenfolge und erklärt, warum der Hauptübergang zunimmt. Die beiden Änderungen, die wir an der Cholesterinstruktur vorgenommen haben, beeinflussen deren hydrophobe Eigenschaften; in beiden Varianten verschwindet die intrinsische Unterschattung von Cholesterin. Wenn diese Moleküle der Doppelschicht hinzugefügt werden, ist kein zusätzliches Screening der hydrophoben Wechselwirkungen erforderlich, und diese Moleküle verhindern die Bildung einer geordneten Phase.

Lassen Sie uns unsere Beobachtungen mit den vorherigen Modellen vergleichen, die eingeführt wurden, um den Kondensationseffekt zu erklären. Erstens gibt unser Modell keinen Hinweis auf eine weiträumige Ordnung, wie sie im Supergittice-Modell angenommen wird. Sowohl im Umbrella-Modell als auch in den kondensierten Komplexen ist die Annahme einer Art lokaler Organisation implizit. Beispielsweise wird im Umbrella-Modell angenommen, dass ein Lipidmolekül ein oder zwei benachbarte Cholesterinmoleküle screenen könnte (siehe z.B. Ref. 2). Unsere Simulationen zeigen eine viel ungeordnetere Struktur, in der wir diese geordneten Strukturen nicht identifizieren können. An dieser Stelle ist es wichtig, daran zu erinnern, dass unser Modell viele Annahmen enthält, und dies wirft die Frage auf, ob die Schlussfolgerungen, die wir aus unseren Simulationen ziehen, für die experimentellen Systeme relevant sind. Wir waren sehr überrascht zu sehen, dass wir in der Lage waren, ein so reiches Phasenverhalten zu erhalten, indem wir ein grobkörniges Modell verwendeten, das rein abstoßende Kräfte verwendete. Unser Modell gibt eine sehr vernünftige quantitative Beschreibung der jüngsten experimentellen Daten über die Struktur der Doppelschicht. Der andere interessante Aspekt ist, dass unsere Berechnungen vorhersagen, dass der Kondensationseffekt in einem engen Temperaturbereich oberhalb des Hauptübergangs maximal ist. Es könnte möglich sein, dies experimentell zu überprüfen. Ein sehr strenger Test unseres Modells wäre ein detaillierter Vergleich mit dem experimentellen Phasendiagramm gewesen. In diesem Zusammenhang ist es ermutigend, dass die gefundenen Phasen experimentell beobachtet wurden, wenn auch nicht immer für genau das simulierte System. Durch die sorgfältige Auswahl der experimentellen Daten, die mit unseren Simulationen übereinstimmen, konnten wir sogar eine sehr gute Übereinstimmung behaupten. Ein möglicher Grund für die Meinungsverschiedenheiten zwischen den verschiedenen Experimenten ist, dass unterschiedliche Techniken verwendet werden und nicht alle Techniken gleichermaßen empfindlich auf die Unterschiede in der Struktur der verschiedenen Phasen reagieren. Wir hoffen, dass die Kombination aus einem Phasendiagramm und detaillierten Informationen über die Struktur der verschiedenen Phasen einige Richtlinien gibt, ob eine bestimmte experimentelle Technik einen bestimmten Phasenübergang identifizieren kann.