Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Die Einverständniserklärung wurde von allen Probanden eingeholt.
Material
Die folgenden Silberverbände wurden verglichen: Acticoat (Smith&Smith, UK; in diesem Artikel als Ac bezeichnet), Aquacel Ag + Extra (Convatec, UK; in diesem Artikel als Aq bezeichnet), Silvercel Hydro-Alginate (Systagenix, UK; in diesem Artikel als Sc bezeichnet) und Ialugen Plus (IBI, Tschechische Republik; in diesem Artikel als Ia bezeichnet).
Andere Chemikalien wurden von Sigma–Aldrich (St. Louis, USA) bezogen, wenn nicht anders angegeben.
Herstellung von Extrakten
In mehreren Assays wurden Extrakte aus Verbänden anstelle der Verbände selbst verwendet. Diese Extrakte wurden unter Verwendung von physiologischer Kochsalzlösung (0,9% (w / v) NaCl) oder Zellkulturmedien, die mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) ergänzt wurden, hergestellt. Das Verhältnis der Verbandfläche zur Lösung betrug 1 cm2 pro 4 ml Lösung. Die Extraktion erfolgte 72 h bei RT unter ständigem Rühren. Die Extrakte wurden durch Passieren eines 0,2 µm Filters sterilisiert und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
Silberkonzentrationsmessung
Die Silberkonzentrationen in Verbänden und den Extrakten von Verbänden wurden mit ICP-OES gemessen. Die Silberkonzentration wurde auch in Ex-vivo-Hautproben von Schweinen bewertet. 10-70 mg jeder Probe wurden zum Mikrowellenaufschluss in ein PTFE-Gefäß überführt. Anschließend wird 1 ml konzentrierte Salpetersäure (Spurenanalysegrad, Analytika Ltd., Tschechische Republik), 0.8 mL konzentrierte Salzsäure (Spurenanalytik, Analytika Ltd., Tschechische Republik) und 0,2 ml Wasserstoffperoxid (p.a. 30%, Penta Ltd. Tschechische Republik) hinzu. Die Probe wurde 5 min bei 150°C und dann im zweiten Schritt desselben Zyklus 10 min bei 200°C digeriert. Nach dem Aufschluss wurde die Probe mit 0,2 ml Wasserstoffperoxid und entionisiertem Wasser quantitativ überführt.
Die Analyse wurde mit einem ICP-OES-Instrument (Radial 725, Agilent Technologies, Australien) durchgeführt, das mit einem pneumatischen Sea-Spray-Vernebler und einer zyklonischen Sprühkammer ausgestattet war. Die Quantifizierung basierte auf einer externen Kalibrierung. Die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Methode wurden anhand von Schweinehautproben getestet, die mit bekannten Ag-Konzentrationen aus einer zertifizierten Referenzlösung (Analytika Ltd., Tschechien).
Rasterelektronenmikroskopie
Rasterelektronenmikroskopische (REM) Analysen wurden mit einem Zeiss Ultra Plus Instrument (Zeiss, Deutschland) durchgeführt. Die Proben wurden in einem Quorum SC7620 Sputtercoater mit einer dünnen Schicht Au/Pd beschichtet. Die Bilder wurden von zwei sekundären InLens- und SE2-Elektronendetektoren für eine höhere bzw. niedrigere Vergrößerung aufgenommen. Die Abtastparameter waren wie folgt: Beschleunigungsspannung, 3,5 kV; Sondenstrom, 36 pA; und Druck in der Kammer, ~ 7 × 10-5 Pa.
EDX-Bilder wurden mit dem Zeiss Ultra Plus Instrument aufgenommen. Röntgenkarten und Spektren wurden mit einem Röntgendetektor X-MaxN 80 (Oxford Instruments, UK) aufgenommen. Die EDX-Parameter waren wie folgt: Beschleunigungsspannung, 10 kV; Sondenstrom, 300 pA; Arbeitsabstand, 8,5 mm; und Prozesszeit, 4.
Direkte oxidative Aktivität von Dressings
Die Erzeugung von ROS unter zellfreien Bedingungen wurde unter Verwendung von 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB) als Substrat für Meerrettichperoxidase (HRP) bewertet. Aus den Verbänden wurden Kreise mit einem Durchmesser von 6 mm ausgeschnitten und getestet. Kurz gesagt, die Arbeitslösung bestand aus 0,1 mg / ml TMB (Stammlösung c = 1 mg / ml in DMSO) gemischt 1:9 mit 0,05 M Citrat–Phosphat-Puffer (pH = 5) und HRP (final c = 0,16 IE /ml). Jedes Verbandstück wurde in 0,5 ml der Arbeitslösung getaucht und Proben (25 µL) wurden bei 0, 5, 7,5 und 10 min gesammelt. Unmittelbar nach der Entnahme wurden die Proben im Verhältnis 1:1 mit 0,16 M H2SO4 gemischt und die Absorption bei 450 nm (Referenzwellenlänge = 540 nm) mit einem NanoDrop OneC Instrument (ThermoFisher Scientific, US) abgelesen. Als Positivkontrolle wurden 30% H2O2 verwendet. Das Hintergrundsignal (leere Lösung) wurde subtrahiert.
Silberpenetration in de-epithelisierte Haut
Wir haben statische Diffusionszellen verwendet, um die Silberpenetration in de-epithelisierte Haut zu untersuchen. Die Haut wurde aus einem örtlichen Schlachthof (Bocus, Letohrad, Tschechische Republik) gewonnen und aus dem inneren Teil der Schweineaurikel herausgeschnitten. Das Haar wurde rasiert, die Haut in PBS (60 ° C, 90 s) inkubiert und die Epidermis abgezogen. Die durchschnittliche Dicke der entepithelisierten Haut betrug 2 mm. Die Hautstücke wurden in eine Kammer gelegt und mit einem getesteten Silberverband oder einem Stück Gaze bedeckt. Jede Spenderkammer wurde mit 0,3 ml NHDF-Kulturmedium mit 10% FBS gefüllt. Die Akzeptorkammer enthielt 0,7 ml Kulturmedium. Die Diffusionszellen wurden 24 oder 48 h bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Haut mit PBS gespült und die Teile der Haut, die die Spender- und Akzeptorkammern trennten, wurden wie oben beschrieben mit ICP-OES auf Silbergehalt analysiert. Die Menge an Silber, die durch die entepithelisierte Haut drang, wurde in der Spenderflüssigkeit gemessen. Zu beiden Zeiten wurden drei unabhängige Replikate erstellt.
Kultivierung von Ex vivo-Haut mit Dressings
Frische (1-2 h) Schweineaurikel (Bocus) wurden sorgfältig mit Seife und Betadin (einer PVP-Jodlösung, Egis Pharma, Ungarn) gereinigt und mit Wasser gespült. Die Hautstücke (1 × 1 cm) von den Ohrmuscheln wurden herausgeschnitten und in antibiotische Lösung (Penicillin–Streptomycin-Lösung, 10.000 U /ml Penicillin, 10 mg /ml Streptomycin) für 30 min bei 37 ° C unter atmosphärischem O2 und CO2 gegeben. Hautproben mit intakter Epidermis wurden dermalseitig nach oben in 6-Well-Kultivierungsplatten mit 3 ml NHDF-Medium, ergänzt mit 10% FBS, gelegt und dann mit 1 × 1 cm ausgewähltem silberhaltigem Verband oder steriler Kontrollgaze, getränkt mit 300 µl Kultivierungsmedium, bedeckt. Die Proben wurden 24 oder 48 h inkubiert. Anschließend wurde die Haut mit PBS gespült und jedes der Hautexlantate zur histologischen Untersuchung (4% PFA−Fixierung bei 4 °C), Proteinanalyse mittels Western Blot (Schnappgefrieren mit flüssigem Stickstoff) und qPCR (über Nacht in RNAlater (Thermo Fisher Scientific), dann bei -80 °C) in Drittel aufgeteilt.
Histologische Färbung
Die autometallographische Färbung von Silber wurde nach Danscher et al.49. Die Bilder wurden mit einem Eclipse 50i-Mikroskop mit angeschlossener DS-Fi1-Kamera (Nikon, Yokohama-Shi, Japan) aufgenommen.
Zur Immunfluoreszenz von yH2AX wurden histologische Schnitte auf Superfrost Plus-Objektträgern (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) deparaffiniert und über Nacht mit Primärantikörper (1:1.000, ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, Klon JBW301, Millipore, MA, USA) inkubiert. Anschließend wurden sie für 1 h mit einem Sekundärantikörper (ab150114, Abcam, Cambridge, UK; Verdünnung 1:10 000) inkubiert und auf Objektträger mit einem Diamond Antifade Mountant mit DAPI (ThermoFisher Scientific) montiert. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japan) aufgenommen.
Genexpression
Schweinehaut nach Inkubation mit Dressings wurde zur RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und qPCR-Genexpression verarbeitet, wie zuvor von Klein et al.Für die qPCR wurden 50 TaqMan Real-Time PCR Assays (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) verwendet: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. Modell: RPL13A, Ss03376908_u1. Die Schwellenzykluswerte wurden auf das RPL13A-Housekeeping-Gen normalisiert und für die jeweilige Zeit (24- oder 48-h−Intervall) unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode51 auf Gaze-Kontrollproben bezogen. Sechs unabhängige Proben für jede Behandlung und Zeit wurden gemessen und gemittelt. Die Signifikanz der Unterschiede in der Genexpression im Vergleich zur Mullkontrolle wurde unter Verwendung des studentischen T-Tests für jeden Silberverband in der angegebenen Zeit bewertet.
Western Blotting
Für die anschließende Western Blot Analyse wurden Gewebelysate aus gefrorener Schweinehaut hergestellt. Mit einem Skalpell in einem Tropfen Lysepuffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% Natriumdeoxycholat; 1% Natriumdodecylsulfat; 4% Harnstoff) wurde die Haut in kleine Stücke geschnitten, die anschließend in 350 µl des Lysepuffers unter Verwendung einer 5 mm Edelstahlperle und eines Gewebehomogenisators (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Deutschland) für 10 min bei 25 Hz homogenisiert wurden. Die Proteinkonzentration wurde mittels BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) gemessen.
Proteine in Lysaten wurden mittels 4-15% Gradient SDS-PAGE aufgetrennt und auf Polyvinylidendifluoridmembranen transferiert. Zum Nachweis spezifischer Proteine wurden Membranen über Nacht in einem Blockierpuffer (20 mM Tris; 137 mM NaCl; 0,05% Tween 20) inkubiert; 5% getrocknetes fettarmes Milchpulver) mit dem Primärantikörper Phospho-Histon H2A.X (20E3) (1:1.000; Cell Signaling, US). β-Actin wurde als Proteinmengenbeladungskontrolle verwendet (1:2000; Santa Cruz, US). Die Membranen wurden mit HRP-konjugiertem Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Ig unter Verwendung von Chemilumineszenzdetektion zur Visualisierung von Signalen entwickelt (Clarity Western ECL substrate; Bio-Rad, US). Die Signale wurden mit einem Alliance 9.7 Chroma Chemiluminescence Imaging System (UVItec Limited, UK) abgetastet und ausgewertet.
Antibakterielle Aktivität
Die Agardiffusionsmethode wurde verwendet, um die antimikrobiellen Aktivitäten der Verbände zu vergleichen. Ein Probenstück (1 cm2) jedes Verbandes wurde auf einer frisch inokulierten Petrischale entweder mit Staphylococcus aureus oder Pseudomonas aeruginosa inkubiert; diese Stämme wurden aus menschlichen chronischen Wunden isoliert, charakterisiert und wie zuvor beschrieben kultiviert52. Zusätzlich wurde die antimikrobielle Wirksamkeit von Verbandextrakten (hergestellt in RPMI-Medium mit 10% FBS, wie oben beschrieben) mittels der Mikroverdünnungsmethode53 verglichen. Die optische Dichte wurde mit einem Ensight Multimode-Plattenleser (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) bei 600 nm für 24 h (Schütteln, 37°C) gemessen.
Zellkultur
Normale humane dermale Fibroblasten aus adulter Haut (NHDF) wurden von Lonza (Basel, Schweiz) bezogen. NHDF wurden in Dulbecco’s Modified Eagles Low Glucose Medium (DMEM) kultiviert, ergänzt mit 10% FBS, Glutamin (0,3 mg/ml), Glucose (4 mg/ml), Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (0,1 mg/ml) in 75 cm2 Kulturflaschen unter 5% CO2 und bei 37 °C bis zur fünften Passage. HaCaT-Keratinozyten wurden von der Firma Hölzel Diagnostika (Köln, Deutschland) bezogen und in gleicher Weise kultiviert, jedoch ohne Zugabe von Glucose zum Medium.
Lebensfähigkeitsmessung
Fünftausend Zellen pro Well wurden in einer 96-Well-Platte mit 200 µL des Kulturmediums mit 10% FBS in einem Inkubator (37°C, 5% CO2) über Nacht ausgesät. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 200 µL einer Verdünnungsreihe von Extrakten aus den Verbänden behandelt (100%, 50%, 20%, oder 10% des ursprünglichen Extrakts verdünnt mit Kulturmedium, ergänzt mit 10% FBS) für 24, 48 und 72 h. Kontrollzellen wurden mit einem Standard-10% igen FBS-Kulturmedium behandelt. Die Lebensfähigkeit wurde wie zuvor beschrieben54 unter Verwendung des 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) -Assays gemessen. MTT-Stammlösung (20 µL; c = 5 mg/ml) wurde dem Zellkulturmedium in jeder Vertiefung zugesetzt. Die Platten wurden 2,5 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die MTT-Lösung entfernt, 220 µL Lyselösung (1:1 Propan-2-ol mit DMSO, 10% (w/v) Triton X-100 und 0,37% (w/v) HCl) zugegeben und 30 min bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler (150 rpm) lysiert. Die Absorption wurde bei 570 und 690 nm mit einem EnSight Multimode Plate Reader (PerkinElmer, USA) abgelesen. Die Daten wurden in Kaleido (PerkinElmer, USA) verarbeitet. Die Endabsorption wurde als A = A570 – A690 berechnet. Die Änderung der Lebensfähigkeit behandelter Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen wurde berechnet als Änderung = (Eine Probe/Eine Kontrolle – 1) × 100.
Direct contact inhibition assay
Die Zellen wurden mit einer Dichte von 300 000 Zellen pro Well in einer 6-Well-Platte ausgesät und in dem mit 10% FBS ergänzten Kulturmedium bei 37 ° C und unter 5% CO2 inkubiert, bis die Konfluenz erreicht war. Verbände wurden in Quadrate von 1 cm 2 geschnitten, auf die Zellschicht gelegt und 6 h mit dem Standardkulturmedium inkubiert. Kontrollzellen wurden nur mit dem Medium behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 15 min mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Zellen wurden mit 0,1% (w/v) Kristallviolettlösung (gelöst in 10% Ethanol) eine Stunde lang angefärbt und anschließend mit Wasser gespült. Die Hemmzonen wurden mit einer Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f Digitalkamera (Canon) fotografiert.
Fluoreszenzfärbung von Zellen
Zur DNA-Schadensanalyse wurden NHDF-Zellen auf Objektträgern in eine 6-Well-Platte mit einer Dichte von 2 × 105 pro Well ausgesät und über Nacht haften gelassen. Am Folgetag wurden die Zellen mit 5× verdünnten Verbandextrakten behandelt und 24 h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 15 min mit 4% PFA fixiert. Nach Permeabilisierung und Blockierung wurden die Objektträger mit einem Anti-yH2AX-Kaninchen-Primärantikörper inkubiert (Cell Signaling, US; 1:500 Verdünnung in einem Blockierpuffer — 20% FBS, 0,3 M Glycin, 0,05% Tween 20 in PBS; über Nacht; 4°C). Der Nachweis erfolgte mit einem mit Alexa Fluor 555 (Abcam, UK; 1:500 in einem Blockierpuffer; 1 h, RT) markierten Sekundärantikörper. Die Objektträger wurden mit dem Diamond Antifade Mountant mit DAPI (ThermoFisher Scientific) montiert. Nach dem Trocknen der Objektträger wurden Bilder mit einem Eclipse Ti Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Yokohama-Shi, Japan) aufgenommen.
Intrazellulärer oxidativer Stress wurde mit einer DCF-DA-Sonde nachgewiesen, die empfindlich auf die Gesamtkonzentration von ROS in Zellen reagiert. Die Zellen wurden über Nacht in einer 24-Well-Platte ausgesät und anschließend 15 min mit DCF-DA (1 µg/ml) markiert, danach mit 5× verdünnten Verbandextrakten behandelt und bei 37°C und unter 5% CO2 inkubiert. Als Positivkontrolle wurden 5 mM H2O2 verwendet. Die grüne Fluoreszenz von DCF wurde alle 15 min während einer Inkubationszeit von 90 min mit einem automatisierten Mikroskop Incucyte S3 (Essen Bioscience, USA) aufgezeichnet. Die Quantifizierung der intrazellulären Fluoreszenz wurde in einer Software nach der von Čepa55 beschriebenen Methode durchgeführt.
Bestimmung des oxidativen Bursts durch Neutrophile im Vollblut
Eine unabhängige Ethikkommission genehmigte die Blutprobenentnahme für den Neutrophilen oxidativen Burst-Assay und MAT (Ethikkommission für Forschung an der Masaryk-Universität, Brünn, Tschechien, Zulassung Nr. EKV-2018-083). Alle Spender gaben ihre schriftliche Zustimmung.
Der oxidative Burst (ROS-Produktion) von Blutphagozyten wurde in verdünntem Vollblut durch luminolverstärkte Chemilumineszenz (CL) unter Verwendung eines LM-01T Mikroplatten-Luminometers (Immunotech, Tschechische Republik) bestimmt. Kurz gesagt bestand die Reaktionsmischung aus 6 µL Vollblut in 54 µl RPMI-1640-Wachstumsmedium gemischt mit 60 µl Verbandextrakt in physiologischer Kochsalzlösung oder einem FBS-supplementierten Medium. Diese Mischung wurde 20 min bei 37°C inkubiert. Kurz vor Beginn der Messung wurde 1 mM Luminol (eine Stammlösung von 10 mM Luminol in einem 0,2 M Boratpuffer) (Molecular Probes, USA) zugegeben. Wir bestimmten die spontane ROS-Produktion und die ROS—Produktion, die durch opsonisierte Zymosan-Partikel (OZP-0,1 mg / ml) (Sigma-Aldrich, USA) oder Phorbol 12—Myristat 13-Acetat (PMA-0,8 µM) induziert wurde; Sigma-Aldrich, USA). Unbehandelte Proben ohne die getesteten Extrakte wurden als Kontrollen ausgewertet. Die Tests wurden in Duplikaten durchgeführt. Die Chemilumineszenz wurde kontinuierlich für 90 min bei 37°C aufgezeichnet und als relative Light Units (RLU) ausgedrückt. Wir haben die Gesamtmenge der ROS-Produktion aus der integrierten Fläche unter der Chemilumineszenzkurve bestimmt.
Monozytenaktivierungstest (MAT)
MAT wurde in 10 × mit Kochsalzlösung verdünntem heparinisiertem humanem Vollblut durchgeführt. Blutproben wurden von fünf gesunden Spendern gesammelt, gepoolt und mit Kochsalzlösung verdünnt. Die verdünnten Blutproben wurden mit aus Dressings geschnittenen Kreisen von 6 mm Durchmesser in sterilen Mikroröhrchen für 24 h bei 37°C inkubiert. Parallel dazu wurde Lipopolysaccharid (LPS, final c = 0. 25 IE / ml; Endotoxin-Standard-E-Toxat; Sigma, US) wurde zu der zweiten Reihe von Proben gegeben, die mit Verbandproben inkubiert wurden, um eine angeborene Immunantwort auf Bakterien zu stimulieren. Blutzellen sedimentierten während der Inkubation und hinterließen eine obere Phase von salzverdünntem Plasma. Nach der Inkubation wurden 200 µL jeder mit Kochsalzlösung verdünnten Plasmaprobe gesammelt und sofort in Duplikaten auf IL-6 mit einem IL-6 Human Uncoated ELISA Kit gemäß dem Herstellerprotokoll (ThermoFisher Scientific, US) getestet. Die Absorption wurde mit einem EnSight Multimode-Plattenleser (Perkin Elmer, US) abgelesen und die endgültige IL-6-Konzentration wurde von Kaleido SW (Perkin Elmer, US) berechnet. Das verbleibende Plasma und die sedimentierten Zellen wurden zur Beurteilung der Hämolyse und Toxizität bei 4 ° C gelagert.
Hämolyse
Hämolyse wurde in den verbleibenden mit Kochsalzlösung verdünnten Plasma- und Sedimentzellen aus MAT nachgewiesen. Nach Zentrifugation wurden 100 µL jeder Probe auf eine 96-Well-Mikroplatte transferiert und die Extinktion bei 550 nm gemessen. Als Positivkontrolle wurde 1% Triton X-100 verwendet.
LDH-Freisetzung
Die Toxizität von Silberverbänden auf Blutzellen wurde mittels Lactatdehydrogenase (LDH) -Assay (Cytotoxicity Detection KitPLUS, Roche, Schweiz) gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Es wurden zwei Quellen von Blutzellen verwendet – menschliches Vollblut, das wie in MAT mit Silberverbänden inkubiert wurde, und isolierte Neutrophile. Die zur Hintergrundkorrektur verwendete Extinktion wurde in Blankproben ohne das LDH-Reagenz gemessen. Die Ergebnisse werden als absolute Werte der optischen Dichte im Vergleich zu einer unbehandelten Probe angegeben.
Statistische Analyse
Wenn nicht anders angegeben, wurde der Student t-Test verwendet, um die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen Proben und unbehandelten Kontrollen zu bewerten.