Bordetella pertussiksen tunnistaminen kriittisesti sairaalla ihmisen Immuunikatovirusinfektoituneella potilaalla Gram-värjätyn materiaalin suoralla Genotyyppianalyysillä ja B: n erottelu. holmesii diagnosoitiin Immunodeficiency virusinfektoituneella ihmisellä uudella menetelmällä, jossa bakteerin DNA monistetaan suoraan ysköksen Gram-värjätyistä dioista käyttämällä ainutlaatuista recA-Geenirajoitusentsyymikohtaa

bakteerien tunnistaminen kliinisistä näytteistä tapahtuu suurelta osin fenotyyppisen karakterisoinnin avulla in vitro-viljelyn ja mikroskopian jälkeen. Suorat Gram-värjätyt valmisteet paljastavat kuitenkin melko harvoin monia eliöitä, mutta viljelmät eivät osoita taudinaiheuttajaa. Tämä kävi ilmi äskettäisestä kliinisestä tapauksesta, jossa 48-vuotias aidsia sairastava mies sai keuhkokoksidioidomykoosin. Sienilääkityksestä huolimatta hänen tilansa ei parantunut. Yskösnäytteistä löytyi useita gramnegatiivisia basilleja suorassa mikroskopiassa, mutta ei taudinaiheuttajia viljelmässä. Lisäksi useista veriviljelmistä kasvoi erittäin nirsoja gramnegatiivisia sauvoja, joita ei pystytty määrittämään tavanomaisin menetelmin.

päätimme yrittää tunnistaa nämä kaksi isolaattia genotyyppisillä menetelmillä käyttäen universaaleja oligonukleotidialkaimia, jotka on suunnattu pieneen alayksikköön rRNA (16S rRNA) – geeniin. Hengitysnäytteistä oli kuitenkin saatavilla vain Gram-värjättyjä dioja. Siksi kehitimme uuden menetelmän, jossa bakteerin DNA otetaan talteen suoraan Gramvaalatusta liukumäestä. Diat värjättiin perinteisellä menetelmällä (12). Kirkas lasilevy tahrattiin näytteillä ja käsiteltiin absoluuttisella metanolilla (Mallinckrodt, Hazelwood, Mo.), jota seuraa lämmön kiinnittyminen 65°C: ssa ja käsittely kristallivioletilla liuoksella (Remel, Lenexa, Kans.). Liukua käsiteltiin edelleen Gramin jodilla (Remel), dekolorisoitiin alkoholi-asetoniliuoksella (3:1) ja vastattiin safraniinilla (Remel). Upotusöljy poistettiin ensin liukumäestä 100-prosenttisella ksyleenillä (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.), minkä jälkeen se huuhdeltiin 100-prosenttisessa etanolissa. Sitten materiaali romutettiin suoralla partakoneen terällä, joka ripustettiin 50 µl Puregene-DNA-hydrataatioliuokseen (Gentra, Minneapolis, Minn.), pyörrytetty ja keitetty 10 min. Veren isolaatin analysointiin käytettiin sekä BACTEC-pullosta että kiinteällä alustalla kasvatetuista pesäkkeistä saatua materiaalia. Tämän jälkeen PCR suoritettiin 50 µl: n tilavuutena, joka sisälsi 5 µl mallia, 1,5 mM MgCl2, 100 µM kutakin deoksinukleosiditrifosfaattia (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind.), 1 U Taq-DNA-polymeraasia (Roche Diagnostics Corporation) ja 0,15 µM (kukin) universal 16s rRNA-alukkeita 11E (5′-GAGGAAGGGATGACG-3′) ja 13b (5′-TCCGGGGCATAAGTG-3′) edellä kuvatulla tavalla (15). 5 min denaturointivaiheen jälkeen 94°C: ssa PCR-vaiheet 94°C 60 sekunnin ajan, 50°C 60 sekunnin ajan ja 72°C 90 sekunnin ajan toistettiin 30 kertaa Perkin-Elmer GeneAmp PCR-järjestelmässä 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Tuotteita saatiin sekä ysköksestä että verestä (Kuva. 1). Nämä puhdistettiin QIAquick PCR-puhdistussarjalla (Qiagen Inc., Valencia, Kalif.), ja DNA-sekvensointi suoritettiin sovelletulla Biosystems ABI3100-sekvensserillä (Hhmi Biopolymer/W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University School of Medicine). BLAST (1) vertasi verisolaattia julkiseen tietokantaan (GenBank) ja totesi sen olevan Helicobacter cinaedi tai Helicobacter rappini. Molempiin organismeihin on liittynyt bakteremioita immuunivajauspotilailla.(9, 10, 13, 16, 17). Respiratorisen isolaatin PCR-tuote vastasi sekä Bordetella pertussiksen että Bordetella holmesiin16s rRNA-geenejä, jotka ovat 99,5% homologisia ja identtisiä monistetulla alueella (18).

Bordetella-hengitystie-isolaatin spekuloimiseksi ja genotyyppianalyysin tuloksen validoimiseksi kehitettiin erotteleva määritys, jossa kohdennettiin recA-geenin (6, 7) osa, joka sisältää ainutlaatuisen restriktioentsyymipaikan. Amplification of B. pertussis (ATCC 9340; American Type Culture Collection, Manassas, Va.) ja B. holmesii (ATCC 51541) DNA sekä potilaan ysköksestä saatu gramvärjäys suoritettiin edellä kuvatulla tavalla, paitsi että 3 mM MgCl2 ja hiljattain suunnitellut erityiset alukkeet (eteenpäin, 5′ – CAATACGCCAAGGGG-3′; ja taaksepäin, 5 ’- TGATGTCGAACTCCCCTGC-3’), ja PCR-vaiheet (94°C 30 s, 59°C 30 s ja 72°C 60 s) toistettiin 45 kertaa, minkä jälkeen viimeinen venymä-vaihe 72°C: ssa.tuotteet sulatettiin ncii: lla valmistajan suositusten mukaisesti (New England Biolabs, Inc. Beverly, Messu.). Nämä kaksi eliötä voidaan helposti erottaa toisistaan, koska B. Holmesilla on kaksi ncii-paikkaa, kun taas B. pertussis ja kaikki muut Bordetella spp. vain yksi ncii-alue vahvistetulla alueella. Yskös-isolaatti tunnistettiin myöhemmin B. hinkuyskäksi (Kuva. 2) ja sitä on raportoitu opportunistisena keuhkopatogeenina ihmisen immuunikatovirusinfektoituneilla potilailla (4, 5).

seuraavaksi selvitimme, onko organismien genotyyppinen tunnistaminen suoraan kliinisistä Gramvärjäysvalmisteista yleispohjaisilla valmisteilla toteuttamiskelpoinen ja toistettavissa oleva menetelmä. Kiinnitystapa (lämpö, 100% metanoli ja 100% etanoli) ja väriainejäämien esiintyminen Gramvärjäyksen jälkeen edellä kuvatulla tavalla eivät vaikuta PCR: ään. Havaitsemisrajaksi todettiin 1 500 pmy/µl ysköstä (6-30 eliötä öljykylpykenttää kohti), mikä on samanlainen kuin muissa raporteissa (14). Tätä löydöstä varten yhdistettiin kolme satunnaista kliinistä yskösnäytettä, joissa ei ollut bakteereita Gramvärjäyksessä tai viljelmässä, ja niihin lisättiin määrätyt määrät Escherichia coli-bakteeria (ATCC 25922), joka oli kiinteä ja gramvärjätty, ja kaavittiin pois diasta edellä kuvatulla tavalla. Testattiin useita satunnaisesti valittuja kliinisiä näytteitä, ja kun vallitseva organismi oli nähtävissä mikroskopiassa, sen tunnistaminen vastasi viljeltyä taudinaiheuttajaa (Taulukko 1).

menetelmällämme on useita etuja aiemmin kuvattuihin määrityksiin verrattuna. Toisin kuin aiemmissa raporteissa, joissa DNA uutetaan ensin ysköksestä ja käytetään lajikohtaisia alukkeita (2, 11, 14, 19, 20), määrityksessämme käytetään DNA: ta, joka on otettu talteen suoraan Gram-värjätyistä dioista ilman uuttovaiheita, ja käytetään universaaleja alukkeita, mikä mahdollistaa laajan bakteerivalikoiman tunnistamisen yksinkertaisella menetelmällä. Kuten on osoitettu, tämä voidaan saavuttaa myös normaalin taustaeläinlajin läsnä ollessa, koska PCR-syklien määrä on rajallinen, mikä mahdollistaa bakteerien DNA: n kilpailukykyisen monistumisen. Koska toimitetun näytteen laatu ja morfologisesti erilaisten mikrobien suhteelliset osuudet voidaan helposti määrittää Gram-tahroista, voidaan valita sopivia tahroja ennen DNA: n monistumista. Lisäksi vallitsevan organismin Gram-tahra-ulkonäkö toimii sisäisenä laadunvalvontana genotyyppisen tunnistamisen jälkeen. Kuten fenotyyppisen tunnistamisen kohdalla, määrityksemme tulosten on korreloitava kliinisen kuvan kanssa ennen hoitopäätöksiä, koska kummallakaan menetelmällä ei voida luotettavasti erottaa kolonisaatiota ja infektiota.

niistä harvoista englanninkielisen kirjallisuuden raporteista, joissa kuvataan nukleiinihapon talteenottoa lasilevyjen kliinisistä näytteistä (3, 8), yksikään ei ole tähän mennessä kuvannut DNA: n monistumista sen jälkeen, kun bakteerit on saatu talteen Gramvaalatuista dioista. Menetelmämme on nopea ja luotettava, ja sitä voidaan käyttää apuvälineenä tapauksissa, joissa organismeja nähdään runsaasti kliinisillä gram-värjätyillä dioilla, mutta niitä ei voida ottaa talteen viljelmässä. Tekniikka voi olla erityisen hyödyllinen silloin, kun diagnoosia haetaan jälkikäteen tai kun alkuperäiset näytteet on heitetty pois.

kiitokset

Kiitämme Yale New Havenin sairaalan kliinisen mikrobiologian laboratorion henkilökuntaa, erityisesti Linda L. postia ja Vincent Piscitelliä, korvaamattomasta avusta ja tuesta.

alaviitteet

i xmlns:hwp=”http://schema.highwire.org/Journalsai 16. i xmlns:hwp=”http://schema.highwire.org/Journal palasi muutettavaksi 10. i xmlns:hwp=”http://schema.highwire.org/Journal hyväksytty 11.

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology