termien ”enzyme units”, ”enzyme activity” ja ”specific enzyme activity” merkityksestä on usein paljon epäselvyyttä. Tässä oppaassa selitetään nämä keskeiset käsitteet yksinkertaisesti ja käsitellään entsyymimäärityksen suunnittelua ja lineaarisella alueella toimimisen merkitystä. Harkitsemme myös standardikäyriä ja sitä, pitäisikö X-akselille piirtää pitoisuus vai absoluuttinen tuotemäärä. Joitakin vinkkejä määrityskontrollien asettamisesta ja tyhjien aihioiden vähentämisestä on keskusteltu. Lopuksi selitämme, miten entsyymin aktiivisuusarvot lasketaan, ja annamme yksinkertaisen yleiskuvan kineettisistä yhtälöistä.
Entsyymiyksiköiden määritelmät
Entsymologia olisi yksinkertaisempaa, jos kaikki käyttäisivät samaa yksikkömääritelmää.
1 yksikkö (U) on entsyymimäärä, joka katalysoi 1 umol substraatin reaktiota minuutissa (määritelmä a).
useimmissa R&d-asetuksissa 1 umol substraattia on itse asiassa melko paljon materiaalia ja muita määritelmiä voidaan pitää parempana, jotta suureita ei ilmaistaisi yksikköjen murto-osina.
1 unit (U) on entsyymimäärä, joka katalysoi 1 nmol substraatin reaktiota minuutissa (määritelmä B).
huomaa, että määritelmän muutoksella on merkittävä vaikutus ilmoitettuun yksikkömäärään eli 1 entsyymiyksikkö määritelmän A mukaan vastaisi 1000 yksikköä määritelmän B mukaan!
voidaan nähdä myös entsyymiyksiköt ilmaistuna milliyksikkönä (tai mU), joka tarkoittaa yksinkertaisesti tuhannesosaa yksiköstä riippumatta siitä, miten yksikkö on määritelty.
on selvää, että entsyymin todellinen määrä putkessa ei muutu pelkästään yksikön määritelmää muuttamalla, vaan eri toimittajilta otettujen näytteiden toimintaa on vertailtava huolellisesti. Niin kauan kuin yksikkömääritelmät on annettu, voidaan ilmoitettu yksikkömäärä muuttaa nmol: ksi / min, mikä on yksiselitteistä ja mahdollistaa pätevien vertailujen tekemisen.
oman työsi selkeyden vuoksi saatat mieluummin käyttää ilmaisua ”nmol per min” (tai ”umol per min”), vaikka jos vaaditaan jatkuvaa toistoa, niin selvästi paljon lyhyemmällä termillä ”yksikkö” on puolensa.
mikä on ”entsyymiaktiivisuus”
aktiivisuus ilmoitetaan yksikköinä / ml (U / ml), toisin sanoen nmol / min / ml (jos yksikkömääritelmä B on hyväksytty). Näin ollen yksikköinä ilmaistuihin aktiivisuusarvoihin kohdistuu myös kuvitteellinen 1000-kertainen ”lisäys”, jos siirrytään yksikkömääritelmästä A yksikkömääritelmään B. Sekavuutta ei myöskään ole, jos aktiivisuus ilmaistaan nmol-arvona min / ml eikä yksikköinä / ml.
koska aktiivisuus liittyy pitoisuuteen, tästä seuraa, että kaksi injektiopulloa entsyymiä voi sisältää saman määrän yksikköjä (yhteensä), mutta niillä on erilainen aktiivisuus (pitoisuudet).
mikä on spesifinen entsyymiaktiivisuus?
spesifinen entsyymiaktiivisuus (ilmaistaan yleensä yksinkertaisesti ”spesifisenä aktiivisuutena”) on entsyymiyksikköjen lukumäärä millilitrassa jaettuna proteiinipitoisuudella mg / ml. Erityiset aktiivisuusarvot ilmoitetaan sen vuoksi yksikköinä/mg tai nmol/min/mg (jos sovelletaan yksikkömääritelmää B).
spesifinen aktiivisuus on tärkeä entsyymin puhtauden mittari, ja puhtaan entsyymin eri erien arvojen tulisi olla samat normaalin kokeellisen virheen rajoissa.
entsyymiliuoksen sarjalaimennoksilla on erilaiset entsyymiaktiivisuusarvot, mutta samat ominaisaktiivisuusarvot, koska erityistä aktiivisuutta laskettaessa näytelaimennus vaikuttaa yhtä lailla osoittajaan (yksikköä/ml) ja nimittäjään (mg / ml).
vaikka spesifinen aktiivisuus on hyvin erilainen kuin aktiivisuus, spesifisen aktiivisuuden laskeminen riippuu kuitenkin aktiivisuusarvosta, joten ilmoitettu ominaisaktiivisuuden arvo riippuu myös entsyymiyksikön määritelmästä. Erät, jotka ovat alle odotetun spesifisen aktiivisuusarvon, voivat sisältää denaturoituneita epäpuhtauksia tai entsyymimolekyylejä.
entsyymin aktiivisuuteen vaikuttavat tekijät
tässä osiossa käsitellään sitä, miksi yhdellä entsyymillä voi olla eri mitatut aktiivisuusarvot eri laboratorioissa. Tällä tarkoitetaan todellisia eroja mitatussa toiminnassa, ei näennäisiä eroja, jotka johtuvat eri yksikkömääritelmien käytöstä.
olosuhteet, joissa määritys suoritetaan, vaikuttavat raportoituihin aktiivisuusarvoihin. Esimerkiksi määritykset suoritetaan tyypillisesti 20-37°C: n lämpötilassa.yleisesti ottaen entsyymi on aktiivisempi 37°C: ssa kuin 20°C: ssa.
entsyymiyksikön määritelmä olisi parempi ilmaista näin:
1 unit (U) on määrä, jos entsyymi katalysoi 1 nmol substraatin reaktiota minuutissa standardiolosuhteissa.
valitettavasti termi”standard conditions”on tulkinnanvarainen ja käyttäjien mieltymyksissä voi olla eroja, ainakin R&d-ympäristöissä. Niinpä kymmenen eri tutkimuslaboratoriota voi (aivan oikein) laskea eri toimintoja samalle entsyymiliuokselle. Useimmat tutkimuslaboratoriot luovat omat ”standardiolosuhteensa” ja tarkastavat jokaisen uuden erän sisäisesti. Kliinisissä asetuksissa on määritelty yksiselitteisesti ”standardiolosuhteet”, ja kaikkien laboratorioiden on suoritettava identtiset testit.
määritysten kehittäminen ja lineaarisen vaihteluvälin merkitys
entsyymisi aktiivisuusarvo (yksikköä / ml) on tärkein parametri määritystä kehitettäessä. Tämä johtuu siitä, että lisäämäsi määrä (eli yksikkömäärä) määrittää substraatin määrän, joka muunnetaan tuotteeksi. Muista, 1 yksikkö katalysoi muuntaminen 1 nmol substraatin per min (määritelmä B).
ilmoitetut yksiköt / ml voivat antaa yleiskuvan lisättävän entsyymin määrästä, mutta koska aktiivisuusarvoa ei välttämättä ole määritetty samanlaisessa testissä kuin sinun, on tavallista valmistaa entsyymin sarjalaimennoksia (esim.log-laimennoksia aluksi) ja testata tietty määrä kutakin laimennosta. Riippuen määrityssignaalista (joka liittyy muunnetun substraatin määrään) toista koetta voidaan tarvita sopivaan laimennukseen.
mikä on ”paras” diluutio? Jotta voimme vastata tähän, meidän on ajateltava määrityksen suunnittelun tärkeintä näkökohtaa – lineaarista aluetta. Kvantitatiivisen työn on tärkeää toimia alueella, jossa määrityssignaalin (usein absorbanssin) käyrä verrattuna entsyymipitoisuuteen on lineaarinen. Useimmat määritykset ovat lineaarisia, jos substraatin muunnosaste on alle 15%, olettaen, että muita rajoittavia tekijöitä ei ole. Määritysajan (esim.30 min) ja lämpötilan (esim. 25oC) määrittämisen avulla muunnosastetta voidaan säädellä yksinkertaisesti säätämällä yhtä parametria eli lisättyjen entsyymiyksiköiden määrää.
Tämä on havainnollistettu graafisesti kuvassa 1, ja laimennokset on ilmaistu vastavuoroisina (eli laimennos on 1/10 = 0, 1 x-akselilla). Oma havaintoalanne voi poiketa muodoltaan ja lineaariselta alueeltaan, mutta hyvin suurella entsyymipitoisuudella määrityssignaali ei epäilemättä kasva samassa suhteessa lisätyn entsyymin määrään.
Kuvan 1 määritys on lineaarinen optiseen tiheyteen (OD) 2,5 asti, ja laimennuskerroin 0,02 (1/50 entsyymin laimennus) olisi ihanteellinen määritystyöhön, koska se antaa suuren signaalin (~1,5) ja sijaitsee lineaarisen alueen keskellä. Laimennuskertoimia 0,04-0,12 (eli aluetta, jolla kaltevuus on alentunut) koskeviin tuloksiin perustuvat laskelmat aliarvioivat entsyymiaktiivisuuden todellisen tason, koska jokin rajoittaa selvästi määrityssignaalin suuruutta.
monet tekijät voivat rajoittaa lineaarista vaihteluväliä, ja vaihteluväli vaihtelee määrityksestä toiseen. Yksi yleinen syy epälineaarisuuteen on substraatin liiallinen kulutus, joka voi aiheuttaa reaktionopeuden laskun, mutta myös levylukijan (tai minkä tahansa mittalaitteen) optisten komponenttien rajoitukset voivat olla merkittäviä. Esimerkiksi useimmat levylukijat eivät pysty luotettavasti mittaamaan yli 3: n absorbanssiarvoja, ja tätä rajoitusta sovelletaan riippumatta tuotteeksi muunnetun substraatin prosenttiosuudesta.
Kuva 1. Absorbanssi vs. entsyymimäärä
vaikka tässä oppaassa ei muuten käsitellä entsyymiä, on myös otettava huomioon, että entsyymit voivat denaturoitua ajan mittaan, varsinkin jos ne ovat hyvin laimeita, ja joidenkin reaktioiden tuotteet voivat estää entsyymiä. Epälineaariselle käyttäytymiselle on toki muitakin mahdollisia syitä, mutta lineaarinen vaihteluväli on yleensä suhteellisen helppo löytää yrityksen ja erehdyksen avulla käyttämällä edellä kuvattuja entsyymin sarjalaimennoksia.
Määritysaika ja lämpötila
nämä parametrit voivat myös vaikuttaa lineaariseen alueeseen, koska ne vaikuttavat substraatin muuntumisnopeuteen. Esimerkiksi määritys voi olla lineaarinen 15 minuutin kuluttua, mutta 60 minuutin kohdalla substraattia on saattanut kulua liikaa. Tässä tilanteessa sinun olisi vähennettävä entsyymimäärää, jotta voit suorittaa määrityksesi 60 minuutin ajan. Sama pätee määrityslämpötilaan, koska se voi vaikuttaa myös reaktionopeuteen.
useimmat ihmiset käyttävät määritysaikaa noin 15-60 minuuttia. Hyvin lyhyitä aikoja (esim.2 min) on vältettävä, koska pieni viivytys reaktion pysäyttämisessä johtaa merkittävään virheeseen aktiivisuuden laskemisessa. On tärkeää varmistaa, että jääkaapissa tai pakastimessa säilytettävät reagenssit ovat tasapainossa oikeaan lämpötilaan ennen käyttöä, ja tämä on erityisen tärkeää, jos määritysaika on suhteellisen lyhyt.
Määritystilavuus/herkkyys
käytännön näkökulmasta määritystilavuus määritetään / rajoitetaan määrityksissä käytettävän tarvikkeen (esim.kupetit, putket tai mikromuovit) perusteella. Useimmissa entsyymimäärityksissä signaali on verrannollinen määritystilavuuteen, ja jos määritystä yritetään pienentää (esim.reagenssien säästämiseksi), signaalit ovat yleensä pienempiä. Absorbanssimääritykset ovat kuitenkin usein poikkeus, ja esimerkiksi siirtyminen 3ml cuvettesta 1ml mikrocuvetteen ei muuta absorbanssilukemaa, jos Cuvetten leveys (polun pituus) on edelleen 1 cm (ts. valo kulkee edelleen samanpituisen nesteen läpi). Tämä johtuu siitä, että absorbanssi on verrannollinen polun pituuteen, ei näytteen tilavuuteen.
mikrotiitterin absorbanssimäärityksissä polun pituus on yhtä suuri kuin nesteen syvyys, ja on mahdollista pienentää signaalin menettämättä pienentämällä kuoppien halkaisijaa ja pitämällä nesteen syvyys vakiona. Esimerkiksi 96 hyvin levyt mahtuu helposti 200ul näyte, mutta 50ul määritys tilavuus olisi parempi käyttää 384-hyvin levy lisätä polun pituus yli nähdään 50ul näytteen 96 – hyvin levy.
jatkuvat Määritykset (tuotteen ulkonäön mittaaminen ajan mittaan)
useimmat määritykset suoritetaan määräajaksi (päätepisteen määritykset) ja reaktio pysäytetään lisäämällä pysäytysreagenssia (esim.happo). Jatkuvissa määrityksissä tuotteen ulkonäkö (harvemmin substraatin kulutus) kirjataan kuitenkin jatkuvasti (esim. karttanauhurin avulla). Samat perussäännöt pätevät; tietyn entsyymimäärän signaalin ja ajan käyrän on oltava lineaarinen ja nopeuden on kaksinkertaistuttava, jos entsyymimäärä kaksinkertaistuu. Niin kauan kuin määritystä käytetään lineaarisella alueella, asianmukaisesti laimennettujen ”tuntemattomien” aktiivisuus voidaan määrittää tarkasti standardeilla mitattujen ensimmäisten reaktionopeuksien perusteella.
mitä Substraattipitoisuutta minun pitäisi käyttää?
substraatin konsentraatio vaikuttaa reaktionopeuteen, mutta ”oikean” konsentraation valinnassa on otettava huomioon useita tekijöitä. Käytännön näkökulmasta yksi keskeinen näkökohta on tuotteen määrä, joka on tuotettava, jotta voidaan antaa mitattavissa oleva signaali. Koska entsyymireaktion nopeus todennäköisesti laskee, kun yli 15% substraatista on hydrolysoitu, substraatin alkukonsentraation on yleensä oltava vähintään 10-kertainen siihen tuotteeseen nähden, jonka tiedetään antavan hyväksyttävän määrityssignaalin.
toinen huomio on substraatin kilometrimäärä. Vaikka lisäämällä substraattia yleensä tarkoittaa, että näet korkeampia aktiivisuusarvoja, suhde ei ole lineaarinen ja substraatin kustannuksia voidaan joutua harkitsemaan. Tässä vaiheessa lienee hyödyllistä ottaa käyttöön klassinen Michaelis-Menten-yhtälö:
v = (Vmax s)/(Km + s) ……………. Eqn. (1)
missä v on nopeus, Vmax on suurin mahdollinen nopeus, S On substraattipitoisuus ja Km on yhtä suuri kuin substraattipitoisuus, joka antaa puolet maksimiaktiivisuudesta. Tämän yhtälön ja sen taustaoletusten derivointi voidaan löytää mistä tahansa entsyymikinetiikkaa käsittelevästä tekstikirjasta. Vaikka on normaalia mitata eikä laskea entsyymireaktioiden nopeutta, on hyödyllistä ymmärtää taustalla olevat periaatteet määrityksen suunnittelua varten.
Michaelis-Menten-yhtälö on sikäli hyödyllinen, että sen avulla voidaan valita sopiva substraattipitoisuus, jos Km on tiedossa.
kun S=Km, v = (Vmax s)/2s eli v/Vmax = s / 2s = ½.
toisin sanoen entsyymi toimii 50% siitä maksiminopeudella, kun S=Km.
korvaamalla yhtälössä 1 arvot s = 10 ja Km = 1 näet, että nostamalla substraatin pitoisuutta 10-kertaiseksi entsyymi toimii nyt ~90% siitä maksiminopeudella 50%: n sijaan. Tämä on selvästi suurempi, mutta ei 10-kertainen.
hyvin suurilla substraattipitoisuuksilla Km yhtälössä 1 muuttuu numeerisesti merkityksettömäksi ja mitattu nopeus on silloin yhtä suuri kuin Vmax.
monissa määrityksissä käytetään substraattipitoisuutta Km: n arvolla tai sen ympärillä, mutta jos Km on hyvin korkea, ei välttämättä ole mahdollista käyttää näin suurta substraattipitoisuutta (esim. kustannussyistä tai vähäisen liukoisuuden vuoksi).
joissakin tilanteissa voi olla jopa suositeltavaa käyttää suhteellisen pientä substraattipitoisuutta. Esimerkiksi lääkeainelöydössä erittäin korkeiden substraattipitoisuuksien käyttö vaikeuttaisi kilpailevien entsyymin inhibiittorien tunnistamista (kilpailevat inhibiittorit sitoutuvat samaan kohtaan substraatin kanssa).
on löydettävä tasapaino eri tekijöiden välillä, jotta määrityksellä on mitattavissa oleva signaali, sitä voidaan käyttää lineaarisella alueella ja se voi saavuttaa muut määritystavoitteet (esim.kustannukset, aika ja niin edelleen).
Standardikäyrät
standardikäyrä tarvitaan aina, jos halutaan laskea entsyymiaktiivisuus. Se ei ole olennaista, jos olet kiinnostunut vain suhteellisista aktiivisuusarvoista.
standardikäyrä muodostetaan mittaamalla määrityssignaali reaktiotuotteen standardiliuoksilla sopivalla pitoisuusalueella. Ihannetapauksessa sinun pitäisi suorittaa standardikäyrä jokaiselle kokeelle, mutta jos standardikäyrä on erittäin toistettavissa, se voi olla hyväksyttävää suorittaa sitä säännöllisesti.
tyypillinen standardikäyrä on esitetty alla olevassa kuvassa 2. Tämä on atpaasimäärityksen standardikäyrä, jossa ATP hydrolysoidaan ADP: ksi ja PI: ksi (epäorgaaninen fosfaatti).
kuva 2. Standardikäyrä pi
fosfaatti havaitaan väriä sitovan reagenssin avulla, joka muuttaa väriä fosfaatin läsnä ollessa. Tämän testin erityispiirteillä ei kuitenkaan ole tässä merkitystä; riippumatta tuotteen luonteesta tai käytetystä havaitsemismenetelmästä on muodostettava standardikäyrä, joka osoittaa signaalin riippuvuuden määrityksessä olevan tuotteen määrästä. Käyrää (mieluiten suoraa viivaa) käytetään määritettäessä tuotetun tuotteen määrä näytteissä, joiden aktiivisuutta ei tiedetä, eli absorbanssiarvosta, lukemalla leikkauspiste x – akselilta. (Useimmat graafiset ohjelmistopaketit laskevat automaattisesti X: n arvot Y: n mitatuista arvoista). Aktiivisuuden määrä voidaan sitten laskea (KS.myöhemmin).
Piirränkö konsentraation tai absoluuttisen määrän X-akselille?
tässä ei ole yhtä oikeaa vastausta, ja mahdollisuus käyttää jompaakumpaa lähestymistapaa voi usein aiheuttaa sekaannusta, kun aktiivisuusarvoja lasketaan. Esimerkiksi tuotteen nmol: n piirtäminen X-akselille on erittäin kätevää, jos sinun on laskettava aktiivisuusarvot (muista, aktiivisuus = nmol / min / ml). Laboratorioreagenssit valmistetaan kuitenkin yleensä tunnetuilla pitoisuuksilla, ja nämä arvot on usein helpompi piirtää x-akselille. Kun kuitenkin lasket entsyymisi aktiivisuutta (tai spesifistä aktiivisuutta), sinun on muistettava muuntaa X-akselin pitoisuus muodostuneiden nmolien lukumääräksi, mikä tarkoittaa, että sinun on otettava huomioon määritystilavuus. Syy on helppo ymmärtää: 50ul ja 100ul tilavuudet standardiliuosta ovat samassa pitoisuudessa, mutta suurempi tilavuus sisältää kaksi kertaa tuotteen määrän. Yleensä on parasta valita yksi lähestymistapa (eli joko piirtää tuotteen absoluuttinen määrä tai pitoisuus) niin, että käytetään aina samaa menetelmää aktiivisuuden laskemiseksi.
kontrollit ja Nollatietojen vähennys
oikeat kontrollit ovat erittäin tärkeitä kvantitatiivisessa työssä, samoin kontrollitietojen oikea käyttö laskelmissa.
kontrollit kertovat (epäsuorasti), kuinka suuri osa määrityssignaalista johtuu entsyymin vaikutuksesta ja kuinka paljon syntyy muista syistä. Yleinen ”väärän” signaalin lähde on substraatti (joka voi usein olla tuotteen saastuttama). Myös muut määrityskomponentit voivat antaa pienen signaalin riippuen komponenttien luonteesta ja määritystyypistä. Kontrollien tarkoituksena on, että voit poistaa (vähentämällä) kaikki kokonaissignaalin elementit, jotka eivät liity entsyymin toimintaan. Jos määritys on hyvin suunniteltu ja määritysreagenssit ovat hyvälaatuisia, kontrollien käsittely on yleensä melko yksinkertaista.
alla on joitakin yleisiä ohjeita:
jos palaamme kolorimetriseen määritykseen epäorgaanisen fosfaatin havaitsemiseksi, voimme korostaa joitakin mahdollisia ongelmia, jotka havaitaan helposti asianmukaisilla kontrolleilla.
fosfaatintunnistusreagenssi antaa matalan lukeman noin 0,08 96 – porauslevyllä mittauksessa käytetyllä aallonpituudella (noin 650 nm).
voidaan määrittää seuraavat määritykset/kontrollit (lukemat suluissa hypoteettisessa määritystilanteessa):
- kaikki määrityskomponentit miinus entsyymi (0, 5)
- entsyymi yksinään (0, 1)
- entsyymi plus kaikki muut komponentit (1, 8)
selvästi määrityssignaali 1, 8 ei johdu pelkästään entsyymin vaikutuksesta substraattiin.
kaikissa entsyymimäärityksissä keskeinen kontrolli (A) on jättää entsyymi pois (ja korvata se puskurilla). Tämä antaa taustasignaalin kaikille muille määrityskomponenteille ryhmänä, mukaan lukien substraatti, joka voi sisältää pienen määrän tuotetta. Tämä kontrolli ei kerro entsyymin taustasignaalia, mutta selvästikään entsyymiä ei voi lisätä substraattiin kontrolliksi! Useimmissa määrityksissä entsyymi ei anna signaalia, koska se laimenee merkittävästi ennen käyttöä määrityksessä. Tämä voidaan helposti tarkistaa, kuten B edellä.
edellä esitetyt näytteen A tiedot viittaavat siihen, että seos on epäorgaanisen fosfaatin saastuttama. Yksittäiset komponentit voidaan sitten tarkistaa ongelman lähteen tunnistamiseksi. Tämä tilanne on melko yleinen atpaasien ja muiden fosfaattia tuottavien entsyymien määrityksissä, koska substraatit ovat usein epästabiileja ja osittain hydrolysoituja, jolloin saadaan jonkin verran epäorgaanista fosfaattia.
raakatietojen korjaaminen voi olla hankalaa, jos useat osat antavat vääriä signaaleja; ongelman poistaminen lähteestä on yleensä paljon parempi kuin mikään matemaattinen käsittely. Edellä olevan näytteen C ”korjattu” arvo voi olla 1,2 (ts. 1.8 – 0.5 – 0.1) mutta tarkkaan ottaen tämä on väärin. Muista määrityslevy ja tunnistusreagenssi antavat taustasignaalin noin 0,08, joten suurimman osan ohjaussignaalista lähde on levyn muovi ja / tai tunnistusreagenssi. Sama pieni signaali on myös piilotettava entsyymiohjauksen arvoon. Näin ollen korjaus sovelletaan edellä olemme vähentäneet tämän piilotettu tyhjä kahdesti.
kontrollit on aina vähennettävä määritystuloksista, ja on suositeltavaa yhdistää kaikki aineet (paitsi entsyymi) ja vähentää yksi arvo. Jos käytetään tätä lähestymistapaa, standardikäyrää käsitellään samalla tavalla ja siitä vähennetään kontrolliarvo (toisin sanoen arvo, joka saadaan tuotteen puuttuessa, eli vastaava kuin edellä mainittu levy/reagenssinäyte). Näin ollen vähennetyt määritystiedot tai vähennetty standardikäyrä eivät sisällä levy – /määritysreagenssin mahdollisesti aiheuttamaa harhaanjohtavaa taustasignaalia.
lopuksi, kuten olemme nähneet, väärät signaalit on helppo havaita asianmukaisilla kontrolleilla, mutta paras strategia laadukkaan tiedon saamiseksi on käyttää reagensseja, joiden taustat ovat matalat niin, että kontrolliarvot ovat matalat. On myös hyödyllistä luoda määrityssignaali (entsyymin vuoksi), joka on paljon suurempi kuin mikään taustasignaali. Ihannetapauksessa signaali-Tausta-suhde olisi vähintään 5 ja mieluiten 10 tai enemmän tarkkaa kvantitatiivista työtä.
Aktiivisuusarvojen laskeminen
Tämä on melko helppo ymmärtää, jos laskemme takaisin raa ’ an määritystietojen perusteella vaiheittain. Esimerkiksi sanokaamme, että olemme tuottaneet 10nmol tuotetta entsyymireaktiossamme (eli määritetty signaalin vakiokäyrästä tuotteen absoluuttista määrää vastaan). Koska aktiivisuus ilmaistaan nmol: na min / ml, aktiivisuuden laskemiseksi on otettava huomioon aika ja tilavuus sekä ehkä vähemmän selvästi entsyymin määrä ja laimennus.
Jos määritys on 10 min pitkä, edellä olevassa esimerkissä nmol: n määrä minuuttia kohti on 1. (Vaihe 1)
Jos määritystilavuus on 200ul, meidän on kerrottava 5: llä (eli 1000/200), jotta saadaan nmol / min / ml. (Vaihe 2)
Tämä arvo liittyy entsyymin aktiivisuuteen määrityksessä, ei määrityksessä käytettävässä entsyyminäytteessä. Alkuperäisen entsyyminäytteen entsyymiaktiivisuuden määrittämiseksi tarvitaan vielä joitakin korjauskertoimia.
entsyymi on voitu laimentaa ennen käyttöä, ja määrityksessä olevat muut aineosat on laimennettava edelleen. Jos määrityksessä (yhteensä 200ul) on 20ul entsyymiä ja entsyymi esilaimennetaan 1/100 ennen 20ul-näytteen lisäämistä, voit todennäköisesti nähdä, että meidän pitäisi kertoa ensin 10: llä (Vaihe 3) ja sitten 100: lla (Vaihe 4), jotta saadaan entsyymin aktiivisuus alkuperäisessä entsyymiliuoksessa.
toistaiseksi tämä on suhteellisen suoraviivaista. Mainitsimme kuitenkin aiemmin, että konsentraatio piirretään usein standardikäyrän X-akselille. Näin ollen arvot voidaan ilmaista mmol-arvoina (ei mmol), eikä mmol-arvoa voi määrittää pelkästään tarkastelemalla standardikäyrää.
koska mM tarkoittaa mmoleita litrassa, meillä on ero implisiittisen tilavuuden 1L ja todellisen määritystilavuuden välillä. Niinpä jos meillä on 10mm tuote ja määrityksen tilavuus on 200ul, meidän on jaettava 5000: lla saadaksemme tuotteen mmolien määrän.
saatat huomata, että jakaminen 5000: lla tässä kumoaa joitakin edellä vaadittuja kertolaskuoperaatioita. On todellakin aivan normaalia, että korjauskertoimet kumoutuvat. Esimerkiksi 10 minuutin määrityksessä, jossa käytetään 1/10 laimennettua entsyymiä, jaetaan 10: llä, jotta saadaan nmol / min, ja kerrotaan 10: llä myöhemmin laimennuskertoimen korjaamiseksi.
tästä seuraa, että jos käytät aina standardimääritysolosuhteita (ts. standardisi), voit kertoa ” x ” – arvon standardikäyrästä yhdellä yleisellä korjauskertoimella, joka kattaa kaikki muut yksittäiset korjauskertoimet, laskeaksesi aktiivisuusarvosi. Vasta ensimmäisellä kerralla täytyy tunnistaa yksittäiset korjauskertoimet.
entsyymin inhibitio/Lääkeseulonta
Tämä on entsymologian ala, jolla on edelleen tarve toimia lineaarisella alueella, mutta jolla aktiivisuusarvojen laskeminen ei yleensä ole relevanttia; sen sijaan suhteellinen reaktionopeus (tai muodostuneen tuotteen suhteellinen määrä) testiaineen läsnä ollessa ja ilman sitä on avainasemassa, mikä edellyttää vain yksinkertaisia laskelmia, joissa käytetään nollasta vähennettyjä määritystuloksia. Kun aihiot on vähennetty, muodostuneen tuotteen määrä ilmoitetaan prosentteina määrästä, joka saadaan ilman testiainetta (eli 100%). Nämä määritykset voidaan joskus suorittaa melko alhaisilla signaali-Tausta-suhteilla, koska kysymys – estääkö testiaine reaktion?
– vaatii vain Kyllä / Ei-vastauksen.
Yhteenveto
tässä oppaassa on toivottavasti annettu selkeät selitykset ”entsyymiyksiköistä”, ”entsyymiaktiivisuudesta” ja ”spesifisestä entsyymiaktiivisuudesta” sekä yksikkömääritelmistä ja ”lineaarisen vaihteluvälin” merkityksestä. Yksityiskohdat siitä, mitä piirretään standardikäyrien X-akselilla, ovat käyttäjän mieltymyksistä, mutta toimintaa laskettaessa tarvitaan jonkin verran huolellisuutta. Määrityskontrollit ovat tärkeitä, mutta laadukkaiden reagenssien käyttö on parempi kuin taustojen poistaminen matemaattisin menetelmin. Suuri signaali-taustasuhde on suotavaa kvantitatiivisessa työssä, ja useita parametreja voidaan vaihdella määrityssignaalin lisäämiseksi; aina ei ole tarpeen yksinkertaisesti lisätä entsyymiä. Entsyymiaktiivisuusarvot voidaan laskea helposti, jos keskeisten määritysmuuttujien tunnistamiseen käytetään vaiheittaista lähestymistapaa.
Katso lisää protokollia ja oppaita