kaikki menetelmät toteutettiin asiaa koskevien ohjeiden ja määräysten mukaisesti. Tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta tutkittavilta.
materiaali
seuraavia hopeasidoksia verrattiin: Acticoat (Smith&veljenpoika, UK; viitataan tässä artikkelissa nimellä Ac), Aquacel AG + Extra (Convatec, UK; viitataan tässä artikkelissa nimellä Aq), Silvercel Hydro-Alginaatti (Systagenix, UK); jäljempänä tässä artiklassa ’Sc’) ja ’Ialugen Plus’ (IBI, Tšekki; tässä artiklassa ’Ia’).
muita kemikaaleja saatiin Sigma–Aldrichista (St. Louis, USA), ellei toisin mainittu.
uutteiden valmistus
useissa määrityksissä käytettiin sidoksista saatuja uutteita eikä itse sidoksia. Nämä uutteet valmistettiin fysiologisella keittosuolaliuoksella (0,9% (w / v) NaCl) tai soluviljelyaineilla, joita täydennettiin 10% sikiäin-seerumilla (FBS). Sidosalueen suhde liuokseen oli 1 cm2 / 4 mL liuosta. Uutto suoritettiin 72 tunnin ajan RT: ssä jatkuvalla ravistelulla. Uutteet steriloitiin johtamalla ne 0,2 µm: n suodattimen läpi ja varastoitiin 4 °C: ssa käyttöön asti.
Hopeapitoisuuden mittaus
sidosten ja sidosuutteiden hopeapitoisuudet mitattiin ICP-OES-menetelmällä. Hopeapitoisuus arvioitiin myös sian ex vivo-ihonäytteistä. Kustakin näytteestä 10-70 mg siirrettiin PTFE-astiaan mikroaaltouunissa tapahtuvaa digestiota varten. Sitten 1 mL väkevää typpihappoa (trace analysis grade, Analytika Ltd., Tšekki), 0.8 mL väkevää kloorivetyhappoa (trace analysis grade, Analytika Ltd., Tšekki) Ja 0, 2 mL vetyperoksidia (p. a. 30%, Penta Ltd., Tšekki) lisättiin. Näytettä sulatettiin 150 °C: ssa 5 minuutin ajan ja sitten saman syklin toisessa vaiheessa 200 °C: ssa 10 minuutin ajan. Digestion jälkeen näyte siirrettiin kvantitatiivisesti käyttäen 0,2 mL vetyperoksidia ja deionisoitua vettä.
analyysi tehtiin ICP-OES-laitteella (Radial 725, Agilent Technologies, Australia), joka oli varustettu pneumaattisella Merisuihkusumuttimella ja syklonisuihkukammiolla. Kvantifiointi perustui ulkoiseen kalibrointiin. Menetelmän tarkkuus ja luotettavuus testattiin siannahkanäytteillä, joihin oli lisätty tunnettuja Ag-pitoisuuksia sertifioidusta vertailuliuoksesta (Analytika Ltd., Tšekki).
Pyyhkäisyelektronimikroskopia
Pyyhkäisyelektronimikroskopia (SEM) analysoitiin käyttäen Zeiss Ultra Plus-instrumenttia (Zeiss, Saksa). Näytteet päällystettiin ohuella Au/Pd-kerroksella Quorum SC7620-sputteripäällysteellä. Kuvat otettiin kahdella sekundaarisella InLens-ja SE2-elektroninilmaisimella suurempaa tai pienempää suurennusta varten. Skannausparametrit olivat seuraavat: kiihdytysjännite, 3,5 kV; koettimen virta, 36 pA; ja paine kammiossa, ~ 7 × 10-5 Pa.
EDX-kuvat napattiin Zeiss Ultra Plus-instrumentilla. Röntgenkartat ja spektrit otettiin X-MaxN 80-röntgenilmaisimella (Oxford Instruments, UK). EDX-parametrit olivat seuraavat: kiihdytysjännite, 10 kV; koettimen virta, 300 pA; työskentelyetäisyys, 8,5 mm; ja prosessiaika, 4 .
sidosten suora oksidatiivinen vaikutus
ROS: n muodostumista soluttomissa olosuhteissa arvioitiin käyttämällä 3,3′,5,5′-tetrametyylibentsidiiniä (TMB) piparjuuriperoksidaasin (HRP) substraattina. Sidoksista leikattiin halkaisijaltaan 6 mm: n ympyrät ja testattiin. Käyttövalmis liuos oli 0, 1 mg / mL TMB:tä (kantaliuos c = 1 mg/mL DMSO: ssa) sekoitettuna 1: 9: ään 0, 05 M: n sitraattifosfaattipuskurin (pH = 5) ja HRP: n (lopullinen c = 0, 16 IU/mL) kanssa. Jokainen sidospala upotettiin 0, 5 mL: aan työliuosta ja näytteet (25 µL) kerättiin 0, 5, 7, 5 ja 10 minuutin kuluttua. Heti keräyksen jälkeen näytteet sekoitettiin suhteessa 1:1 0,16 M H2SO4: llä ja absorbanssi luettiin 450 nm: ssä (viiteaallonpituus = 540 nm) NanoDrop onec-laitteella (ThermoFisher Scientific, US). Positiivisena kontrollina käytettiin 30% H2O2: ta. Taustasignaali (tyhjä liuos) vähennettiin.
hopean tunkeutuminen de-epitelisoituneeseen ihoon
käytimme staattista diffuusiota Franz-soluja tutkiaksemme hopean tunkeutumista de-epitelisoituneeseen ihoon. Nahka saatiin paikallisesta teurastamosta (Bocus, Letohrad, Tšekki), ja se poistettiin sian korvalehden sisäosasta. Hiukset ajeltiin, iho inkuboitiin PBS: ssä (60 °C, 90 s) ja orvaskesi kuorittiin pois. Ihosoluista poistetun ihon keskimääräinen paksuus oli 2 mm. ihokappaleet laitettiin kammioon ja peitettiin testatulla hopeasidoksella tai harsokankaalla. Jokainen luovuttajakammio täytettiin 0, 3 mL: lla NHDF-viljelyainetta, jossa oli 10% FBS: ää. Vastaanottokammiossa oli 0, 7 mL viljelyainetta. Diffuusiokennoja inkuboitiin 37 °C: ssa 24 tai 48 tunnin ajan. Inkubaation jälkeen iho huuhdeltiin PBS: llä, ja ne ihon osat, jotka erottivat luovuttaja-ja vastaanottajakammiot, analysoitiin hopeapitoisuuden määrittämiseksi ICP-OES: n avulla edellä kuvatulla tavalla. Ihon läpi tunkeutuneen hopean määrä mitattiin luovuttajan nesteestä. Molemmilla kerroilla valmistettiin kolme itsenäistä kopiota.
ex vivo-ihon viljely sidoksilla
tuoreet (1-2 h) sian auricles (Bocus) puhdistettiin huolellisesti saippualla ja Betadinella (PVP-jodiliuos, Egis Pharma, Unkari) ja huuhdeltiin vedellä. Korvalehtien ihokappaleet (1 × 1 cm) poistettiin ja laitettiin antibioottiliuokseen (penisilliini–streptomysiiniliuos, 10 000 U/mL penisilliiniä, 10 mg/mL streptomysiiniä) 30 minuutin ajan 37 °C: ssa ilmakehän O2: ssa ja CO2: ssa. Ihonäytteet, joissa orvaskesi oli ehjä, laitettiin ihon puolelta ylöspäin 6-kuoppaisiin viljelylevyihin, joissa oli 3 mL NHDF-kasvualustaa täydennettynä 10-prosenttisella FBS: llä ja jotka sitten peitettiin 1 × 1 cm valikoidulla hopeaa sisältävällä sidoksella tai steriilillä kontrolliharsolla, joka liitettiin 300 µl: lla viljelyainetta. Näytteitä inkuboitiin 24 tai 48 tunnin ajan. Sen jälkeen iho huuhdeltiin PBS: llä ja jokainen ihoräjähdys jaettiin kolmasosiin histologista tutkimusta varten (4% PFA − kiinnittyminen 4 °C: ssa), proteiinianalyysi Western blot-menetelmällä (snap-jäädytys nestemäisellä typellä) ja qPCR-testi (yön yli Rnalaterissa (Thermo Fisher Scientific), sitten-80 °C: ssa).
histologinen värjäytyminen
hopean autometallografinen värjäytyminen hyväksyttiin danscherin et al.49. Kuvat otettiin Eclipse 50i-mikroskoopilla, johon oli liitetty DS-Fi1-kamera (Nikon, Yokohama-Shi, Japani).
yH2AX:n immunofluoresenssin osalta superfrostin ja lasilevyjen histologiset osat (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) poistettiin ja inkuboitiin yön yli primaarisella vasta-aineella (1: 1 000, ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, clone JBW301, Millipore, MA, USA). Sen jälkeen niitä inkuboitiin 1 tunnin ajan sekundaarisella vasta-aineella (ab150114, Abcam, Cambridge, UK; diluutio 1:10 000) ja asennettiin dioihin, joissa oli ProLong Diamond Antifade Mountant with Dapi (ThermoFisher Scientific). Kuvat otettiin Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japani) – loistemikroskoopilla.
geeniekspressio
siannahka sidoksilla tapahtuneen inkubaation jälkeen käsiteltiin RNA-eristämistä, cDNA-synteesiä ja qPCR-geeniekspressiota varten, kuten Klein et al on aiemmin kuvannut.QPCR: ään käytetyt 50 Taqman-reaaliaikaista PCR-määritystä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) olivat: Dnaja1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. Kynnysarvot normalisoitiin rpl13a-taloudenhoitogeeniin, ja ne liittyivät tietyn ajan (24 tai 48 tunnin välein) harsokontrollinäytteisiin käyttäen 2 – ΔΔCt-menetelmää 51. Kustakin käsittelystä ja ajasta mitattiin ja laskettiin keskiarvo kuudesta erillisestä näytteestä. Geeniekspression erojen merkitystä suhteessa harsokontrolliin arvioitiin opiskelijan t-testillä jokaiselle hopeasidokselle määrätyssä ajassa.
Western blotting
myöhempää Western blot-analyysiä varten valmistettiin kudoslysaatteja pakastetusta siannahasta. Skalpellin käyttäminen pisarassa liukupuskuria (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0, 5% natriumdeoksikolaattia; 1% natriumdodekyylisulfaattia; 4% ureaa), iho leikattiin pieniksi paloiksi, jotka sitten homogenoitiin 350 µl: ssa lysis-puskuria käyttäen ruostumattomasta teräksestä valmistettua 5 mm: n helmeä ja kudoshomogenisaattoria (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Saksa) 10 minuutin ajan 25 Hz: n taajuudella. Proteiinipitoisuus mitattiin BCA protein assay kit-testillä (Thermo Fisher Scientific).
lysaattien proteiinit erotettiin 4-15%: n gradientin SDS-sivun avulla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridikalvoille. Tiettyjen proteiinien havaitsemiseksi kalvoja inkuboitiin yön yli estopuskurissa (20 mM Tris; 137 mM NaCl; 0,05% Tween 20; 5% kuivattu vähärasvainen maitojauhe), jossa on ensisijainen vasta-aine fosfohistoni H2A.X (20e3) (1:1000; Cell Signaling, US). β-aktiinia käytettiin proteiinimäärän lastauskontrollina (1: 2000; Santa Cruz, Yhdysvallat). Kalvot kehitettiin HRP-konjugoidulla Anti-rabbit – tai anti-mouse Ig – tekniikalla käyttäen kemiluminesenssitunnistusta signaalien visualisointiin (Clarity Western ECL substrate; Bio-Rad, US). Signaalit skannattiin ja arvioitiin Alliance 9.7 Chroma Chemiluminescence Imaging Systemillä (UVItec Limited, UK).
antibakteerinen vaikutus
sidosten antimikrobista vaikutusta verrattiin agar-diffuusiomenetelmällä. Näytekappale (1 cm2) kustakin sidoksesta inkuboitiin Staphylococcus aureus-tai Pseudomonas aeruginosa-vasta inokuloidulla Petrimaljalla; nämä kannat eristettiin ihmisen kroonisista haavoista, jotka on kuvattu ja viljelty edellä kuvatulla tavalla 52. Lisäksi sidosuutteiden antimikrobista tehokkuutta verrattiin mikrodiluutiomenetelmällä53 (valmistettu rpmi-väliaineessa, jossa on 10% FBS, kuten edellä on kuvattu). Optinen tiheys mitattiin Ensight-Multimodilevylukijalla (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) 600 nm: n aallonpituudella 24 h (ravistelu, 37 °C).
soluviljelmä
aikuisen ihon normaalit ihmisen ihon fibroblastit (nhdf) ostettiin Lonzasta (Basel, Sveitsi). NHDF: ää viljeltiin dulbeccon modifioidussa Eagles low glukoosiväliaineessa (dmem), jota täydennettiin 10% FBS: llä, glutamiinilla (0, 3 mg/mL), glukoosilla (4 mg/mL), penisilliinillä (100 yksikköä/mL) ja streptomysiinillä (0, 1 mg/mL) 75 cm2: n viljelypulloissa 5% CO2: ssa ja 37 °C: ssa viidenteen läpikulkuun saakka. HaCaT keratinosyytit ostettiin Hölzel Diagnostikalta (Köln, Saksa) ja niitä viljeltiin samalla tavalla, mutta ilman glukoosin lisäämistä väliaineeseen.
elinkelpoisuuden mittaus
viisituhatta solua porakaivoa kohti kylvettiin 96-porauslevylle, jossa oli 200 µL viljelyainetta ja 10% FBS: ää inkubaattorissa (37 °C, 5% CO2) yön yli. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin 200 µL laimennussarjalla sidosuutteita (100%, 50%, 20%, tai 10% alkuperäisestä uutteesta laimennettuna viljelyaineella täydennettynä 10% FBS: llä) 24, 48 ja 72 tunnin ajan. Kontrollisolut käsiteltiin 10-prosenttisella FBS-viljelyalustalla. Elinkyky mitattiin edellä kuvatulla tavalla 54 käyttäen 3-(4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidimääritystä (MTT). Kumpaankin kuoppaan lisättiin MTT-kantaliuos (20 µL; c = 5 mg/mL) soluviljelyaineeseen. Levyjä inkuboitiin 2,5 tuntia 37 °C:ssa.sitten poistettiin MTT-liuos, lisättiin 220 µL lyysiliuosta (1: 1 propan-2-oli DMSO: lla, 10% (w/v) Triton X-100 ja 0,37% (w/v) HCl) ja lyysi tehtiin 30 min huoneenlämmössä pyörivällä ravistimella (150 rpm). Absorbanssilukema oli 570 ja 690 nm EnSight-Multimodilevylukijalla (PerkinElmer, USA). Tietoja käsiteltiin Kaleidossa (PerkinElmer, USA). Lopullinen absorbanssi laskettiin a = A570-A690. Käsiteltyjen solujen elinkyvyn muutos suhteessa kontrollisoluihin laskettiin seuraavasti: muutos = (näyte / kontrolli-1) × 100.
suoran kosketuksen inhibitiomääritys
solut kylvettiin 300 000 solun tiheydellä kuoppaa kohti 6-kuoppalevylle ja inkuboitiin viljelyalustassa, johon lisättiin 10% FBS 37 °C: n lämpötilassa ja alle 5% CO2: n lämpötilassa, kunnes konsentraatio saavutettiin. Sidokset leikattiin 1 cm2: n neliöiksi, asetettiin solukerrokselle ja inkuboitiin vakioliuoksella 6 tunnin ajan. Kontrollisolut käsiteltiin vain väliaineella. Sen jälkeen solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 4%: lla paraformaldehydiä 15 minuutin ajan. Solut värjättiin 0,1-prosenttisella (w/v) kideviolettiliuoksella (liuotettiin 10-prosenttiseen etanoliin) tunnin ajan ja huuhdeltiin sitten vedellä. Inhibitioalueet kuvattiin Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f-digikameralla (Canon).
solujen fluoresoiva värjäytyminen
DNA-vaurioiden analysointia varten nhdf-solut kylvettiin mikroskooppilevyille 6-kuoppalevylle, jonka tiheys oli 2 × 105 kuoppaa kohti, ja niiden annettiin kiinnittyä yön yli. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin 5 × laimennetulla sidosuutteella ja inkuboitiin 24 tunnin ajan. tämän jälkeen solut kiinnitettiin 4%: n PFA: lla 15 minuutin ajan. Permeabilisaation ja salpauksen jälkeen dioja inkuboitiin anti-yH2AX—kaniinin primaarisella vasta-aineella (Solusignalointi, US; 1:500 laimennus estopuskuriin-20% FBS, 0, 3 M glysiini, 0, 05% Tween 20 PBS: ssä; yön yli; 4 °c). Osoittamisessa käytettiin toissijaista vasta-ainetta, joka on merkitty Alexa Fluor 555:llä (Abcam, UK; 1: 500 estopuskurissa; 1 h, RT). Diat asennettiin käyttäen ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI (ThermoFisher Scientific). Diakuvien kuivattamisen jälkeen kuvat otettiin Eclipse Ti-loistemikroskoopilla (Nikon, Yokohama-Shi, Japani).
solunsisäinen oksidatiivinen stressi havaittiin DCF-DA-koettimella, joka on herkkä solujen sisäiselle KOKONAISROS-pitoisuudelle. Solut kylvettiin yön yli 24-kuoppalevylle, minkä jälkeen ne merkittiin DCF-DA: lla (1 µg/mL) 15 minuutin ajan, minkä jälkeen ne käsiteltiin 5 × laimennetulla sidosuutteella ja inkuboitiin 37 °C: ssa ja alle 5% CO2: n lämpötilassa. 5 mM H2O2 käytettiin positiivisena kontrollina. DCF: n vihreä fluoresenssi kirjattiin 15 minuutin välein 90 minuutin inkubointijakson aikana automaattisella incucyte S3-mikroskoopilla (Essen Bioscience, USA). Solunsisäisen fluoresenssin kvantifiointi suoritettiin Fidžin ohjelmistoissa Čepa55: n kuvaaman menetelmän mukaisesti.
oksidatiivisen Burstin määrittäminen neutrofiilien avulla kokoverestä
riippumaton eettinen komitea hyväksyi verinäytteen keräämisen neutrofiilien oksidatiivista burst assay-määritystä ja MAT-määritystä varten (Masaryk University, Brno, Czechia, ethical Committee for Research, approval no. EKV-2018-083). Kaikki lahjoittajat antoivat kirjallisen suostumuksensa.
verifagosyyttien oksidatiivinen purkaus (Ros-tuotanto) määritettiin laimennetusta kokoverestä luminolilla tehostetulla kemiluminesenssilla (CL) käyttäen lm-01T-mikrotiitterilumometriä (Immunotech, Tšekki). Reaktioseoksessa oli lyhyesti 6 µL kokoverta 54 µl: ssa rpmi-1640-kasvualustaa sekoitettuna 60 µl: aan sidosuutetta fysiologisessa suolaliuoksessa tai FBS: n täydentämässä väliaineessa. Seosta inkuboitiin 37 °C: ssa 20 minuutin ajan. Juuri ennen mittauksen alkua lisäsimme 1 mM luminolia (10 mM luminolin kantaliuos 0,2 M boraattipuskurissa) (Molecular Probes, USA). Määritimme spontaanin ROS-tuotannon ja opsonoitujen zymosaanihiukkasten (OZP—0.1 mg/mL) (Sigma-Aldrich, USA) tai Forbol 12-myristaatti-13-asetaatin (PMA-0.8 µM; Sigma-Aldrich, Yhdysvallat). Käsittelemättömät näytteet, joissa ei ollut testattuja uutteita, arvioitiin kontrolleina. Määritykset suoritettiin kahtena kappaleena. Kemiluminesenssia kirjattiin yhtäjaksoisesti 90 minuutin ajan 37 °C: n lämpötilassa, ja se ilmaistiin suhteellisina valoyksikköinä (RLU). Määritimme kemiluminesenssikäyrän alaisen integroidun alueen ROS-tuotannon kokonaismäärän.
monosyyttien aktivaatiotesti (mat)
mat tehtiin 10 × keittosuolaliuoksella laimennetulla heparinisoidulla ihmisen kokoverellä. Verinäytteet kerättiin viideltä terveeltä luovuttajalta, yhdistettiin ja laimennettiin suolaliuoksella. Laimennettuja verinäytteitä inkuboitiin 6 mm: n läpimittaisilla sidoksista leikatuilla ympyröillä steriileissä mikrotubeissa 24 tunnin ajan 37 °C: n lämpötilassa.samanaikaisesti lipopolysakkaridi (LPS, lopullinen c = 0. 25 IU/mL; Endotoksiinistandardi E-Toksaatti; Sigma, US) lisättiin toiseen näytesarjaan, joka inkuboitiin sidosnäytteillä synnynnäisen immuunivasteen stimuloimiseksi bakteereille. Verisolut sedimentoituivat inkubaation aikana, jolloin jäljelle jäi keittosuolaliuoksella laimennetun plasman ylempi vaihe. Inkubaation jälkeen 200 µL kutakin suolaliuoksella laimennettua plasmanäytettä kerättiin ja määritettiin välittömästi monisteina IL-6: lle käyttäen IL-6 Human Uncoiled ELISA-pakkausta valmistajan protokollan mukaisesti (ThermoFisher Scientific, US). Absorbanssi luettiin EnSight-Multimodilevylukijalla (PerkinElmer, US) ja lopullinen IL-6-pitoisuus laskettiin Kaleido SW: llä (Perkin Elmer, US). Loput plasmasolut ja sedimentoidut solut säilytettiin 4 °C: ssa hemolyysin ja toksisuuden arviointia varten.
hemolyysiä
hemolyysiä havaittiin jäljellä olevissa suolaliuoksella laimennetussa plasmassa ja sedimentoiduissa soluissa MAT: sta. Sentrifugoinnin jälkeen 100 µL kustakin näytteestä siirrettiin 96-kuoppaiseen mikrotiitteriin ja absorbanssi mitattiin 550 nm: ssä. Positiivisena kontrollina käytettiin 1% Triton X-100: aa.
LDH: n vapautuminen
hopeasidosten toksisuutta verisoluille arvioitiin laktaattidehydrogenaasin (LDH) määrityksellä (Cytotoxicity Detection KitPLUS, Roche, Sveitsi) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tutkimuksessa käytettiin kahta verisolulähdettä: ihmisen kokoverta, jota inkuboitiin HOPEASIDOKSILLA kuten mattoa, ja eristettyjä neutrofiileja. Taustakorjauksessa käytetty absorbanssi mitattiin nollanäytteistä ilman LDH-reagenssia. Tulokset ilmoitetaan optisen tiheyden absoluuttisina arvoina verrattuna käsittelemättömään näytteeseen.
tilastollinen analyysi
ellei toisin mainittu, opiskelijan t-testiä käytettiin arvioimaan otosten ja käsittelemättömien kontrollien välisten erojen tilastollista merkitsevyyttä.