1970-luvulla suurin osa nestekromatografiasta tehtiin kiinteätukiasemafaasilla (jota kutsutaan myös kolonniksi), joka sisälsi muokkaamattomia piidioksideja tai alumiinioksidihartseja. Tällaista tekniikkaa kutsutaan nykyään normaalifaasikromatografiaksi. Koska stationäärifaasi on tässä tekniikassa hydrofiilinen, liikkuvaan faasiin sisältyvillä hydrofiilisillä ominaisuuksilla on suuri affiniteetti stationäärifaasiin ja adsorboituu siksi kolonnipakkaukseen. Hydrofobiset molekyylit kokevat vähemmän affiniteettia kolonnipakkaukseen, ja läpäisevät eluoitumisen ja havaitsemisen ensin. Kolonnipakkaukseen adsorboituneiden hydrofiilisten molekyylien eluointi edellyttää liikkuvassa faasissa hydrofiilisempien tai polaarisempien liuottimien käyttöä stationäärifaasissa olevien hiukkasten jakautumisen siirtämiseksi liikkuvaan faasiin.
Käänteisfaasikromatografia on tekniikka, jossa stationäärifaasihiukkasiin sidotaan kovalenttisesti alkyyliketjuja, jotta saadaan aikaan hydrofobinen stationäärifaasi, jolla on voimakkaampi affiniteetti hydrofobisiin tai vähemmän polaarisiin yhdisteisiin. Hydrofobisen stationäärifaasin käyttö on oleellisesti normaalin faasikromatografian vastakohta, sillä liikkuvien ja stationääristen faasien napaisuus on käännetty ylösalaisin – tästä termi käänteisfaasikromatografia. Käänteisfaasikromatografiassa käytetään polaarista (vesipitoista) liikkuvaa faasia. Tämän seurauksena polaarisen liikkuvan faasin hydrofobiset molekyylit pyrkivät adsorboitumaan hydrofobiseen stationäärifaasiin, ja liikkuvan faasin hydrofiiliset molekyylit kulkevat kolonnin läpi ja eluoituvat ensin. Hydrofobiset molekyylit voidaan eluoida kolonnista vähentämällä liikkuvan faasin napaisuutta orgaanisella (ei-polaarisella) liuottimella, mikä vähentää hydrofobisia vuorovaikutuksia. Mitä hydrofobisempi molekyyli on, sitä voimakkaammin se sitoutuu stationäärifaasiin ja sitä suurempi on molekyylin eluointiin tarvittava orgaanisen liuottimen pitoisuus.
monet muissa kromatografisissa menetelmissä käytetyt matemaattiset ja kokeelliset näkökohdat pätevät myös RPC: hen (esimerkiksi erotustarkkuus riippuu sarakkeen pituudesta). Sitä voidaan käyttää erilaisten molekyylien erottamiseen. Sitä ei tyypillisesti käytetä proteiinien erottamiseen, koska RPC: ssä käytetyt orgaaniset liuottimet voivat denaturoida monia proteiineja. Tästä syystä proteiinien erottamiseen käytetään yleisemmin normaalifaasikromatografiaa. Proteiinien denaturoinnista voi kuitenkin olla hyötyä kromatografiasta saatujen näytteiden myöhemmässä analyysissä. Jos analysoiduille proteiineille tehdään entsymaattinen hajottaminen trypsiinillä, linearisoitu proteiini sopii tähän paremmin. Näin ollen proteiinien denaturointi sopivilla liuottimilla, jotka aiheuttavat proteiinien avautumisen, voi itse asiassa olla tarkoituksellista ennen fraktioidun näytteen ottamista massaspektrometrian avulla.
nykyään RPC on usein käytetty analyyttinen tekniikka. RPC: ssä on käytettävissä erilaisia stationäärifaaseja, mikä mahdollistaa suuren joustavuuden erotusmenetelmien kehittämisessä.
Piidioksidipohjaista stationaarista phasesEdit
mitä tahansa inerttiä polaarista ainetta, jolla saavutetaan riittävä pakkaus, voidaan käyttää käänteisfaasikromatografiassa. Suosituin kolonni on oktadekyylihiiliketjuun (C18) sidottu piidioksidi (USP-luokitus L1). Tämän jälkeen käytetään C8-sidottua piidioksidia (L7), puhdasta piidioksidia (L3), syaanisidottua piidioksidia (L10) ja fenyylisidottua piidioksidia (L11). Huomaa, että C18, C8 ja fenyyli ovat käänteisfaasihartseja, kun taas syanokolonneja voidaan käyttää käänteisfaasitilassa riippuen tutkittavasta ja liikkuvasta faasista. Kaikilla C18-sarakkeilla ei ole samanlaisia retentio-ominaisuuksia. Piidioksidin pintafunktionalisaatio voidaan suorittaa monomeerisessa tai polymeerisessä reaktiossa erilaisten lyhytketjuisten organosilaanien kanssa, joita käytetään toisessa vaiheessa jäljellä olevien silanoliryhmien peittämiseen (päätykatto). Vaikka yleinen retentiomekanismi pysyy samana, eri stationäärifaasien pintakemikaalien hienoiset erot johtavat muutoksiin selektiivisyydessä.
nykyisillä pylväillä on erilainen napaisuus. PFP on pentafluorifenyyli. CN on cyano. NH2 on amino. ODS on oktadekyyli tai C18. ODCN on C18: sta ja nitriilistä koostuva sekamuotoinen kolonni. SCX on voimakas kationinen vaihto (käytetään orgaanisten amiinien erottamiseen). SAX on voimakas anioninen vaihto (käytetään karboksyylihappoyhdisteiden erottamiseen).