High performance liquid kromatography mass spectrometry on erittäin monipuolinen instrumentaalinen tekniikka, jonka juuret ovat perinteisemmän nestekromatografian soveltamisessa teorioihin ja instrumentointiin, jotka kehitettiin alun perin kaasukromatografiaa (GC) varten. Kuten nimestä voi päätellä, instrumentointi koostuu korkean erotuskyvyn nestekromatografista (HPLC), joka on liitetty sopivan rajapinnan kautta MASSASPEKTROMETRIIN (MS). HPLC/MS: n ensisijainen etu verrattuna GC/MS: ään on se, että se pystyy analysoimaan paljon laajempaa komponenttivalikoimaa. Yhdisteet, jotka ovat termisesti labiileja, joilla on suuri polaarisuus tai joiden molekyylimassa on suuri, voidaan kaikki analysoida HPLC/MS-menetelmällä, jopa proteiinit voidaan analysoida rutiininomaisesti. Näytteistä johdetut liuokset ruiskutetaan HPLC-kolonniin, joka koostuu kapeasta ruostumattomasta teräksestä valmistetusta putkesta (pituus yleensä 150 mm ja sisähalkaisija 2 mm tai pienempi), joka on pakattu hienoihin kemiallisesti muunnettuihin piidioksidihiukkasiin. Yhdisteet erotetaan toisistaan niiden suhteellisen vuorovaikutuksen perusteella näiden hiukkasten kemiallisen pinnoitteen (stationäärifaasi) ja kolonnin läpi eluoivan liuottimen (liikkuva faasi) kanssa. Kromatografiakolonnista eluoituvat komponentit johdetaan massaspektrometriin erikoistuneen rajapinnan kautta. Kaksi yleisintä HPLC/MS: n liitäntää ovat electrospray-ionisaatio ja ilmanpaineen kemiallinen ionisaatio.
Elektrospray-ionisaatiossa
elektrospray-ionisaatiossa tutkittavaa ainetta tuodaan lähteeseen virtausnopeuksilla, jotka ovat tyypillisesti luokkaa 1µl min-1. Analyyttiliuoksen virtaus kulkee elektrospray-neulan läpi, jolla on suuri potentiaaliero (suhteessa vastaelektrodiin), jota käytetään (tyypillisesti välillä 2,5-4 kV). Tämä pakottaa ruiskuttamaan neulasta varattuja pisaroita, joiden pintavaraus on sama kuin neulan varauksella. Pisarat karkotetaan neulasta kohti laskurielektrodin näytteenottokartiota (sinisellä). Kun pisarat kulkevat neulan kärjen ja kartion välissä, tapahtuu liuottimen haihtumista. Tämä on ympyröity Viikunassa.1 ja suurennettuna kuviolla.2. Liuottimen haihtuessa pisara kutistuu, kunnes se saavuttaa pisteen, että pintajännitys ei voi enää ylläpitää varausta (Rayleigh-raja), jolloin tapahtuu ”Coulombinen räjähdys” ja pisara repeytyy kappaleiksi. Tämä tuottaa pienempiä pisaroita, jotka voivat toistaa prosessin sekä alastomia varautuneita analyyttimolekyylejä. Nämä varautuneet analyyttimolekyylit (ne eivät ole varsinaisesti ioneja) voivat olla yksittäin tai moninkertaisesti varautuneita. Tämä on erittäin pehmeä ionisointimenetelmä, sillä ionisoituessa analysaatti säilyttää hyvin vähän jäännösenergiaa. Monistettujen varautuneiden molekyylien tuottaminen mahdollistaa suuren molekyylipainon komponenttien, kuten proteiinien, analysoinnin, koska massaspektrometrin massa-alue kasvaa huomattavasti, koska se mittaa itse asiassa massan ja varauksen suhdetta eikä massaa sinänsä. Suurin haitta tekniikka on, että hyvin vähän (yleensä ei) fragmentaatiota tuotetaan, vaikka tämä voidaan poistaa käyttämällä tandem-massaspektrometrisiä tekniikoita, kuten MS/MS tai MSn.
Figure 1 a schematic of an eri interface
Figure 2 a schematic of the mechanism of ion formation
Atmospresse chemical ionisation
Atmospresse chemical ionisaatio (apci) on analoginen ionisointimenetelmä kemialliselle ionisaatiolle (Ci). Merkittävä ero on siinä, että APCI esiintyy ilmanpaineessa ja sillä on ensisijaisia käyttökohteita pienimassaisten yhdisteiden ionisoitumisalueilla (APCI ei sovellu termisesti labiilien yhdisteiden analysointiin). Yleinen lähdeasetelma (KS. 3) muistuttaa vahvasti ESI: tä. Missä APCI eroaa ESI: stä, on tapa, jolla ionisaatio tapahtuu. ESI: ssä ionisaatio ostetaan suunnilleen ruiskuneulan ja kartion potentiaalieron kautta sekä nopealla mutta lempeällä autioitumisella. APCI: ssä analyyttiliuos tuodaan pneumaattiseen sumuttimeen ja desolvataan kuumennetussa kvartsiputkessa ennen kuin se reagoi koronapurkauksen kanssa muodostaen ioneja. Koronapurkaus korvaa ELEKTRONIFILAMENTIN CI: ssä – Ilmanpaine ”polttaisi” nopeasti kaikki hehkulangat-ja tuottaa primääriset N2°+ ja N4°+ elektronien ionisaatiolla. Nämä primääriset ionit törmäävät höyrystyneisiin liuotinmolekyyleihin muodostaen sekundaarisia reaktanttikaasu-ioneja-esimerkiksi H3O+ ja (H2O) nH+ (KS. 4). Tämän jälkeen nämä reaktanttikaasuionit joutuvat toistuviin törmäyksiin analyytin kanssa, jolloin muodostuu analyyti-ioneja. Törmäysten suuri taajuus johtaa analyyti-ionien suureen ionisointitehokkuuteen ja termisaatioon. Tämä johtaa pääasiassa molekyylilajeja edustaviin spektreihin ja addukti-ioneihin, joissa on hyvin vähän sirpaloitumista. Kun ionit ovat muodostuneet, ne siirtyvät pumppaus-ja fokusointivaiheeseen paljolti samaan tapaan kuin ESI.
kuva 3 a schematic of the components of an APCI source
Kuva 4 a more detailed view of the mechanism of APCI
Diagrams and text (partial) by Dr Paul Gates, School of Chemistry, University of Bristol