aerobisen biologian tulo julistettiin noin kaksi miljardia vuotta sitten, kun primitiiviset syanobakteerit kehittivät kyvyn fotooksidisoida vettä. Happi vapautui jätetuotteena, ja ilmakehän O2-tasot nousivat nopeasti. Tämä nopea muutos hapekkaaseen ilmakehään toi mukanaan tuhoisan saasteen, mutta lopulta kehittyi eliöitä, jotka käyttivät hyväkseen O2: n vähentämiseen johtavaa voimakasta voimaa. Hapen sitomiseen ja aktivoimiseen kykenevät entsyymiaktiiviset paikat kehittyivät, ja uudet biokemian luokat, jotka käyttävät O2: ta termodynaamisena nieluna muuten epäedullisten reaktioiden ajamiseen, tulivat mahdollisiksi. Ruoka-aineenvaihdunnan tehokkuus muuttui dramaattisesti. Esimerkiksi glukoosia aerobisesti metaboloimalla tuotetun ATP: n määrä kasvoi lähes 20-kertaiseksi. Eukaryootit ilmestyivät pian oksygeenisen ilmakehän jälkeen, ja niitä seurasi lopulta nykyinen monisoluisten eliöiden kirjo. Aerobisessa biokemiassamme O2: ta käytetään lukuisissa synteettisissä reaktioissa, jotka ovat olennaisia lähes kaikille solujen kasvun, kehityksen ja lisääntymisen osa-alueille.
biokemiallisesta monipuolisuudestaan huolimatta >95% kuluttamastamme hapesta käytetään hengityksessä. Ravinnosta saadut suurienergiset elektronit kulkevat mitokondrion elektroninsiirtoketjussa eksergonisten redox-reaktioiden sarjassa. Näitä energeettisesti alaspäin suuntautuvia elektroninsiirtoja käytetään kehittämään kemisosmoottinen protonigradientti, joka lopulta tuottaa ATP: tä. Happi on viimeinen elektronien vastaanottaja tässä hengityskonekaskadissa, ja sen pelkistymistä vedeksi käytetään välikappaleena, jolla pienienergisten, käytettyjen elektronien mitokondrioketju tyhjennetään. Tätä prosessia katalysoiva entsyymi, sytokromioksidaasi, ulottuu mitokondrion kalvoon. Se sitoo, aktivoi ja vähentää jopa 250 molekyyliä O2: ta sekunnissa ja liittää tässä prosessissa vapautuvan energian kemiosmoottista gradienttia edistävien protonien translokaatioon. Mekanismia, jolla sytokromioksidaasi katalysoi tätä merkittävää kemiaa, on tutkittu intensiivisesti. Fabianin, Wongin, Gennisin ja Palmerin tässä numerossa raportoimat tulokset antavat uutta tietoa tästä prosessista ja tukevat kasvavaa käsitystä, että yhdistäviä käsitteitä on olemassa tavalle, jolla happea hyödyntävät entsyymit aktivoivat O2: n o⩵o-sidoksen pilkkoutumiseen ja pelkistymiseen (1).
Sytokromioksidaasin O2: n väheneminen tapahtuu vaikeiden rajoitusten alaisena. Prosessi tapahtuu pienellä ylikapasiteetilla, osittain pelkistettyjen, myrkyllisten happivälitteisten aineiden vapautuminen aktiivisesta paikasta minimoidaan, ja O2-pelkistyksessä käytettävissä oleva vapaa energia yhdistetään korkeaan hyötysuhteeseen protonin translokaatioon (2, 3). Entsyymi toimii näissä rajoitteissa käyttämällä heme Fe: tä, jota kutsutaan heme a3: ksi, ja kupari-Ionia, jota kutsutaan CuB: ksi, kaksitumaisessa keskuksessa, jossa O2 sitoutuu ja pelkistyy (KS. Kuva.1).1). Elektronien tulo tähän kohtaan tapahtuu sytokromi c: stä toisen hemiraudan, heme a: n, ja toisen kuparikeskuksen, CuA: n kautta. Viime aikoina yoshikawan ryhmä (4) ja Michelin ryhmä (5) toimittivat itsenäisesti ja samanaikaisesti entsyymin kiderakenteita, jotka ovat antaneet syvällisen käsityksen monista katalyyttisen kierron osa-alueista, erityisesti siitä, miten protonit ja happi todennäköisesti liikkuvat proteiinin läpi. O2: n pelkistymismekanismia oksidaasilla on pyritty toteuttamaan useilla ryhmillä erilaisilla spektroskooppisilla tekniikoilla (tarkennuksia, KS. 6 ja 7). Tästä teoksesta voidaan kirjoittaa yksinkertaistettu reaktiosekvenssi, johon liittyy ohimeneviä, mutta havaittavia välituotteita kaksirenkaisessa keskuksessa seuraavasti (KS.myös kuva. Kuva.2):2):
erityisesti P-ja F-lajit ovat herättäneet huomiota, sillä ne ovat olleet osallisina protonin translokaatiota ajavassa pumppausmekanismissa (8. Michelin (9) ja Wikströmin ja työtovereiden (10) viimeaikaiset työt ovat tuoneet esiin sekä edistyksen että epävarmuuden ymmärryksessämme mekanismista, joka yhdistää eksergoniset elektronit Happeen endergonisella protoniliikkeellä kalvon poikki.
sytokromioksidaasin kaksinukleaarinen keskus. Heme a3 ja CuB esitetään yhdessä proksimaalisen ligandin kanssa heme-raudalle, H376, ja CuB-ligandille, H240, joka on ristisidottu Y244: ään (24, 25). O2: n sitoutuminen ja pelkistyminen tapahtuu A3: n raudan ja CuB: n välisellä alueella.
yksinkertaistettu menetelmä sytokromioksidaasin ja O2: n väliselle reaktiolle. Kaksirenkainen sivusto, joka sisältää heme a3, CuB, ja ristisidottu, H240-Y244 (H – Y) rakenne, on esitetty. Pelkistyminen ja keskustan hapettuneen muodon protonaatio tuottaa pelkistyneen kohdan. Tämä sitoo O2: n muodostaen aluksi oksi-lajin, joka reagoi edelleen tuottaen P-ja F-välituotteita, ennen kuin regeneroi entsyymin hapettuneen muodon. P: n ja F: n pelkistymistä rajoittavat protoninsiirtoreaktiot, kuten on ilmoitettu. P: n ja paikan pelkistetyn muodon väliset askeleet ovat osallistuneet protonipumppausprosesseihin, jotka on merkitty punaisilla nuolilla. Näiden vaiheiden stoikiometriaa tutkitaan parhaillaan, vaikka koko syklin aikana voidaan pumpata jopa neljä protonia.
jatkuva ongelma sytokromioksidaasin kaksinukleaarisessa keskuksessa olevan happikemian ja sen yhteyden protonipumppuun selvittämisessä on välituotteiden molekyylirakenteiden määrittäminen edellä esitetyssä kaaviossa. Konsensuksen mukaan F-välituotteessa on ferryyli-okso-Välituote hemissä a3, A34 + ⩵O (3, 6, 11, 12), P: n rakenteesta on kuitenkin kiistelty paljon. Tämän lajin alkuperäiset tehtävät olettivat, että se sisälsi sidoksen ehjänä, A33+—O2⩵ lajia, joten sen nimitys P tarkoittaa ”peroksi” (esim. 3, 8 ja 13). Weng ja Baker kuitenkin tulkitsivat optisen datansa osoittavan, että O⩵O-sidoksen pilkkoutuminen oli jo tapahtunut P: ssä ja että tälläkin lajilla oli A34+⩵o-rakenne kaksirenkaisessa keskuksessa (14). Tätä päätelmää tukivat myöhemmin useat spektroskooppiset tutkimukset (15-17). Kitagawa, Proshljakov ja heidän työtoverinsa onnistuivat Raman-spektroskopian avulla havaitsemaan A34 + ⩵O-venytysliikkeen (18, 19) P: n muodossa, joka syntyy lisäämällä hapettuneeseen entsyymiin peroksidia. Myöhemmät tutkimukset osoittivat, että sama värähtely voidaan havaita, kun happea lisätään entsyymin kahden elektronin pelkistettyyn muotoon, mikä vahvistaa, että happikemia ja peroksidikemia hapettumisessa etenevät yhteisten välituotteiden kautta (20). Lisäksi P: n ilmestymisen ajankulku tässä teoksessa osoitti, että tämä laji on kineettisesti Pätevä (Katso myös viite. 21 ja 22). Näin ollen spektroskooppisesta työstä ja myös viimeaikaisesta laskennallisesta työstä (23) nousee esiin näkemys, että P On todellakin o⩵O sidos-halkaistu laji.
Fabian et al. (1) tarjoaa uutta, riippumatonta ja vakuuttavaa näyttöä siitä, että O⩵O-sidos pilkkoutuu sytokromioksidaasissa P-tasolla. Kokeissaan he järkeilivät, että kumpikaan sidoksettomassa peroksirakenteessa oleva happiatomi ei todennäköisesti vaihdu liuotinveden kanssa. Jos P kuitenkin esiintyy A34 + ⩵O-lajina, oletetaan, että toinen happiatomi on todennäköisesti hydroksidin tai veden tasolla ja että tämä happi voi hyvinkin vaihtua veden kanssa vesipitoisessa puskurissa. Käyttämällä 18o2: ta substraattina vesipitoisessa puskurissa, joka sisälsi H216O: ta, ne vangitsivat P: n välituotteen ja määritettiin h218o: n esiintymisen varalta. Niiden massaspektrometriset tulokset osoittavat selvästi, että yksittäinen happiatomi 18o2-substraatista on vaihdettavissa liuotinveden kanssa erinomaisessa yhteisymmärryksessä edellä esitetyn analyysin ja P: n osoittamisen kanssa sidokseksi halkaistuna ferryyli-okso-lajina.
sen toteamisella, että P: llä on A34+⩵O-rakenne, on useita merkittäviä vaikutuksia. Sitoutuneen O2: n muuttuminen oksidilajeissa hydroksidiksi (tai vedeksi) ja ferryylioksoksi P: ssä vaatii yhteensä neljä elektronia. Vain kolme on kuitenkin helposti saatavilla kaksirenkaisessa keskuksessa – kaksi heme a3: sta, kun se menee +2: sta +4: ään valenssitilaan, ja yksi Cubista, kun se hapettuu kuparista kupriseksi. Neljännen elektronin lähde on epäselvä. Hemin makrosyklin hapettuminen, jota esiintyy yhdisteissä I eräissä peroksidaaseissa, voidaan eliminoida Ramanin ja optisten tietojen perusteella (6, 7), eikä CU3+: a ole havaittu biologisessa ympäristössä. Todennäköisin ehdokas on siis redox-aktiivinen proteiinin sivuketju, kuten tapahtuu sytokromi-c-peroksidaasissa, jossa tryptofaani on redox-aktiivinen, tai prostaglandiinisyntaasissa, joka sisältää hapettuvaa tyrosiinijäämää (24). Yoshikawa ja työtoverit (25) esittivät hätkähdyttäviä kristallografisia todisteita, jotka tukevat voimakkaasti redox-aktiivisen sivuketjun esiintymistä. He osoittivat, että kaksirenkaisessa keskuksessa Y244 on ristisidottu yhteen CuB-ligandeista, H240: een, ja että fenolipääryhmä on orientoitunut niin, että −OH-ryhmä osoittaa suoraan O2-sidontaonteloon (Kuva. (Kuva.1).1). Michel on raportoinut samanlaisia kristallografisia tietoja (26), ja Buse ja työtoverit ovat äskettäin raportoineet biokemiallisia tietoja, jotka tukevat H240-Y244-ristilinkin esiintymistä (27). Viimeaikaisia EPR-tietoja on myös raportoitu, jotka osoittavat tyrosyyliradikaalien esiintymisen, kun peroksidia lisätään lepäävään entsyymiin, vaikka asiaan liittyviä sivuketjuja ei ole tunnistettu(28, 29). Yhdessä nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että ristisidottu tyrosiini on neljännen elektronin lähde sytokromioksidaasin aktivoituessa ja pelkistäessä O2: ta. Tämä konjektuuri johtaa yksinkertaistettuun reaktiosykliin Figissä. Kuva.2,2, jossa ristisidottu H-Y-rakenne esitetään eksplisiittisesti ja ehdotetaan hapetettavaksi neutraaliksi tyrosyyliradikaaliksi P-välituotteessa.
järjestelmä kuviossa. Kuva.22 korostaa sytokromioksidaasin ja peroksidaasien ja katalaasien välisiä analogioita happi-happi-sidoksen pilkkoutumiskemian ja reaktiosta aiheutuvien tuotteiden osalta. Oksidaasissa entsyymi irrottaa kolme elektronia aktiivisen kohdan metalleista ja neljännen elektronin orgaanisesta osasta pelkistäen O2: n yhdessä vaiheessa O⩵: ksi ja OH—: ksi. Molemmat tuotteet ovat veden tasolla, joskin protonoituminen ja vapautuminen jatkuu vasta reaktion myöhemmissä vaiheissa. Peroksidaaseissa ja katalaaseissa entsyymi irrottaa yhden elektronin aktiivisessa kohdassa olevasta metallista ja toisen elektronin orgaanisesta osasta pelkistäen H2O2: n yhdessä vaiheessa O⩵: ksi ja OH—: ksi. Peroksidaaseissa ja katalaaseissa tämän kemian välitön tuote on yhdiste I, joka sisältää ferryylioksolajia ja orgaanisen radikaalin. Nämä rakenteet ovat täsmälleen analogisia A34 + ⩵o/radikaalirakenteen kanssa, joka esiintyy p: ssä sytokromioksidaasissa. Yhdisteen I orgaaninen radikaali pelkistyy seuraavassa vaiheessa peroksidaasi-ja katalaasientsyymeissä muodostaen yhdistettä II, joka ylläpitää ferryylioksorakennetta. Oksidaasissa esiintyy sama kemia, joka tuottaa F-välituotteen. Happea metaboloivien heme-proteiinien kemian samankaltaisuus on tullut esiin vasta P: n A34+⩵o-rakenteen toteutumisen myötä ja viittaa siihen, että muut happea metaboloivat entsyymit saattavat noudattaa samanlaista kemiaa hapen ja peroksidien aktivoinnissa ja pelkistämisessä.
figistä syntyy mielenkiintoinen strategia. Kuva.22 mitä tulee siihen, miten oksidaasi yhdistää happikemian protonipumppuun. Pumppausvaiheet tapahtuvat vasta P: n muodostuttua (8-10), jolloin entsyymi ensin aktivoituu ja pelkistää O2: n täysin pelkistyneiksi mutta epätäydellisesti protonoituneiksi vesimolekyyleiksi; entsyymi viimeistelee elektronien neljän elektronin siirron hapeksi ja varastoi vapaan energian, joka johtaa voimakkaasti hapettavana a34 + ⩵O ja radikaalilajeina, ennen kuin käynnistää pumpun. Viimeaikaiset laskelmat sidos-pilkkoutumiskemiasta tukevat tätä ajatusta, sillä tulosten mukaan O2: n pelkistyminen oksoksi ja hydroksoksi radikaalin ja ferryyliokson muodostuessa on lähellä termoneutraalia (23). Tämä on huomattavan tehokas strategia myrkyllisten, osittain pelkistyneiden happilajien välttämiseksi, koska niitä ei esiinny reaktiosyklissä. Lisäksi siirtämällä vapaata energiaa, jota käytetään pumpun ohjaamiseen ala-happituotteista proteiiniin, näyttää siltä, että oksidaasi on maksimoinut kontrollin ja tehokkuuden, jolla se voi käyttää protonitranslokaatiolaitteistoa.