PMC

proteiinisynteesin venymävaiheen translokaatiovaiheen aikana mRNA: ta etenee yhdellä kodonilla, johon liittyy trnas: n siirtyminen ribosomaalisesta A: sta (aminoasyyli) P: hen (peptidyyli) ja P: stä E: hen (poistuma) venymätekijän EF-G (1) katalysoimassa prosessissa. Ensin trnat siirtyvät 50s-alayksikössä P/E-ja A/P-hybriditiloihin, minkä jälkeen tRNA anticodon-runkosilmukat (ASLs) siirtyvät 30s-alayksiköstä A-ja P-alayksiköstä P-ja E-alayksiköihin, jotka on yhdistetty niihin liittyvien mRNA-kodonien liikkumiseen (2). Ensimmäiseen vaiheeseen liittyy intersubunit-kierto (3-7), kun taas toiseen vaiheeseen tarvitaan EF-G·GTP, ja siihen liittyy 30s-alayksikön pääalueen kierto (8-11). Vaikka viime aikoina on opittu paljon P-tRNA: n liikkeen rakenteellisesta perustasta e-paikkaan (9, 10, 12, 13), a-tRNA: ta sisältäviä translokaatio-välituotteita on vaikeampi pyydystää. Niinpä suuri osa ajattelustamme A-tRNA: n ja mRNA: n liikkeen rakenteellisesta perustasta on perustunut EF-G: n kiderakenteisiin, jotka ovat sitoutuneet vapaisiin (14) tai P-tRNA: ta sisältäviin ribosomi-komplekseihin, jotka ovat jumissa klassisissa (15) tai hybriditiloissa (10, 12, 13) ja kahdessa 70s: n ribosomi-EF-g: n Kryo-EM: n rakenteessa, jotka sisältävät kaksi Trnaa sitoutuneina P/E ja A/P* hybriditiloissa (16) tai AP/P ja pe/e kimeerisissä hybriditiloissa (11).

tässä kerrotaan 70-luvun ribosomien translokaatioväliaineen kiderakenne, joka sisältää EF – G: n, mRNA: n ja kaksi trnas-A: ta deasyloitua tRNA: ta sitoutuneena pe/E-tilaan ja peptidyyli-tRNA: ta, joka on jumissa AP / ap-kimeerisessä hybriditilassa. Kompleksin muodostivat T. thermophilus 70s-ribosomit, 39-nukleotidi mRNA, venymä trnametti P-kohdassa ja N-asetyyli-Val-tRNAVal a-kohdassa. Trap translokaatio Välituote, lisäsimme neomysiini estää loppuun translokaatio, ja fusidiinihappo estää vapautumisen EF-G (täydentäviä menetelmiä; Fig. S1). Rakenne ratkaistiin yksikiteestä saadun diffraktiodatan avulla arvoon 3,8 Å (taulukko S1). Esimerkkejä elektronitiheydestä on esitetty lisämateriaaleissa (viikunat. S2-S13). Suhteessa klassisen tilan ribosomiin (17) 30S-alayksikön pää pyörii suurella 21° vastapäivään, ja 30S-kappaleen 2,7° kierto suhteessa 50S-alayksikköön (Kuva. 1, kuva 2A, B). P-tRNA anticodon stem-loop (ASL) liikkuu 30s-pään kanssa asentoon 30S-pään P-paikan ja 30s-kehon e-kohdan väliin (pe chimeric state; Kuva 1D, E), kun taas sen hyväksymispää siirtyy täysin 50S E-kohtaan (Kuva 1c) muodostaen PE/E-kimeerisen hybriditilan (9-11). A-tRNA ASL siirtyy sisällä ~4å P-sivuston elementtejä 30S elin (Kuva. 1D); sen kyynärpää pyörii kohti klassista 50S P-sivustoa, mutta sen vastaanottopää on sidottu 50S-alayksikön A ja P-sivustojen välillä (Kuva. 1C), muodostaen AP/ap kimeerisen hybriditilan. 30s-pään suuri, EF-G-riippuva kierto 23S rRNA: n rakenteellisissa repositioissa helix H38, jolloin a-tRNA-kyynärpää pääsee P-sivuston Trna-kyynärpäähän (Kuva. S14). Domain IV EF-G kiilataan sivuston lähentymisen a-sivuston mRNA kodoni, anticodon silmukka ap/ap tRNA, ja 16S ja 23s rRNAs intersubunit silta B2a, samanaikaisesti yhteyttä kaikkiin neljään RNAs (Kuva. S15).

vaikka 30s pään kierto helpottaa selvästi P-alueen ASL-translokaatiota (9-11), A-alueen ASL-translokaatio tapahtuu eri mekanismilla. P-sivuston ASL liikkuu tarkasti 30s pään pyörimisellä pe/E-tilaan, kun taas A-sivuston ASL on siirtynyt pään pyörimisliikettä pidemmälle AP-tilaan 30S-alayksikössä (Kuva. 1 E). Liikkuminen a-sivuston ASL juuri pään kierto johtaisi vakavaan yhteentörmäykseen verkkotunnuksen IV EF-G koska se on sijoitettu meidän monimutkainen, joka yhdessä kontakti muodostuu kärki verkkotunnuksen IV ja kodoni-anticodon helix ap / ap tRNA (Kuva S16), viittaa siihen, että liikkuvuus mRNA ja ASL on kytketty että verkkotunnuksen IV. ylimääräinen Siirtymä ap/ap ASL tuo sen lähelle pe/e ASL (Kuva. 2C, D) (11). Pään asento voidaan vakauttaa interaktiolla 16s rRNA: n fosfaatti 1210: n ja EF-G: n domeenin IV välillä Gly531: ssä.

silmiinpistävin on 30S: n päässä olevan 16S rRNA 966-silmukan uudelleenjärjestely, joka irtautuu P-kohdasta kohti A-kohtaa, jossa se aloittaa kontaktin osittain transloituneeseen ap / ap-ASL: ään (Kuva. 2 E, F). Tässä uudelleenjärjestelyssä m22g966: n pakkaaminen P-sivuston ASL: n (18, 19) riboosi 34: ää vastaan häiriintyy ja AP/ap-ASL: n ympärille muodostuu pintaan sopiva tasku nukleotidien A965, m22G966 ja C1400 avulla. Vastaavan single-tRNA-kompleksin kiderakenteessa (10) (Kuva. S6), pe/E tRNA ASL: n todettiin ylläpitävän kaikkia kanonisia P-sivuston yhteyksiä 30S: n päähän, mukaan lukien 966-silmukka, koska se pyörii kohti E-paikkaa. Tässä raportoidussa kahden tRNA: n kompleksissa säilyy kuitenkin vain osa P-sivuston 30s-pään vuorovaikutuksista pe/e ASL: n kanssa, joihin kuuluvat G1338, A1339, a1340 ja proteiini uS9: n C-terminaalinen häntä. Translokaation jälkeisten interaktioiden muodostuminen samanaikaisesti translokaatiota edeltävien interaktioiden katkeamisen kanssa viittaa mekanismiin, jolla ASL: t periytyvät A-ja P-alueiden välillä. Se voi myös merkitä kosketusten ensimmäistä muutosta, joka on keskeytettävä pe/E tRNA ASL: n vapauttamiseksi ennen 30S: n pään kääntymistä taaksepäin translokaation loppuvaiheessa (20, 21).

EF-G: n, ap / ap ASL: n ja sen mRNA-kodonin (Kuva. S15) (11) ovat samanlaisia kuin translokaation jälkeisessä tilassa (15) havaitut, mikä viittaa siihen, että ne säilyvät koko translokaatiosyklin ajan. Niiden samankaltaisuus A1492: n ja a1493: n ja kodonin ja antikodonin helixin kanssa dekoodauskohdassa (22) tekemien vähäisten uravuorovaikutusten kanssa viittaa siihen, että ne voivat auttaa säilyttämään oikean kodonin ja antikodonin pariliitoksen A-ja P-kohtien välisen liikkeen aikana (15), ja ne ovat yhdenmukaisia ehdotuksen kanssa, jonka mukaan EF-G helpottaa translokaatiota epävakauttamalla vuorovaikutuksia 30s-dekoodauskohdassa (23).

on ehdotettu, että mRNA: n ja 30S: n pään osien väliset vuorovaikutukset alajuoksun mRNA: n tulotunnelissa kuljettaisivat mRNA: ta eteenpäin tRNA: n kanssa pään pyörimisen aikana (17). Ei kuitenkaan ole selvää, että mRNA: n verkkoliikettä voitaisiin ylläpitää tällä tavoin, koska nämä vuorovaikutukset häiriintyvät pään pyörimisen aikana. Huomaamme, että mRNA: n pidennetty pyrstö, kun se nousee alajuoksun tunnelista, kaartuu ylöspäin sitoutuakseen alayksikön päässä olevan proteiinin uS3 pintaan (Kuva. 3, S17). Siten pään eteenpäin kääntäminen siirtäisi mRNA: ta aktiivisesti translokaation suuntaan. Vertailunukleotidin sijainnin vertailu mRNA: ssa pyörivissä ja kiertämättömissä tiloissa osoittaa edelleen, että pään eteenpäin pyöriminen edistäisi mRNA: ta yhdellä kodonilla (Kuva. 3D), mikä tukee mahdollisuutta, että ribosomi liikuttaa mRNA: ta aktiivisesti translokaation aikana. Koska alajuoksun tunnelin mitat estävät RNA-helikaasin pääsyn tunneliin, ribosomaalisen helikaasin (24) on tunnelin sisäänmenon yhteydessä tai sen läheisyydessä vaurioitettava mRNA-sekundaarirakennetta interaktiolla tunnelin ulkopuolella olevan ribosomin kanssa. Tunnelin suuaukkoa välittömästi reunustavan mRNA: n pyrstön Sitominen yksinomaan 30S: n päähän tarjoaa tällaisen vuorovaikutuksen. Pään pyörimisen synnyttämät voimat saattoivat siten horjuttaa mRNA: n kierteisissä elementeissä emäspariutumista niiden saapuessa alajuoksun tunneliin.

klassisessa tilassa P-paikan trnan pyrstön c74 ja C75 muodostavat 23S rRNA: n p-silmukan (H80) kanssa emäsparin G2252 ja G2251, kun taas A-paikan trnan pyrstön C75 A-silmukan (H92) kanssa (18, 25, 26). Nämä interaktiot sijoittavat peptidyyli-ja aminoasyyliosuudet peptidyylitransferaasireaktiolle (27), jolloin P-kohtaan jää deasyloitu tRNA ja A-kohtaan peptidyyli-tRNA. Kriittinen vaihe translokaatiossa on siis peptidyyli-CCA-pään myöhempi siirtyminen a-silmukasta P-silmukkaan. Translokaatiovälin rakenne paljastaa kimeerisen tilan, joka eroaa aiemmin kuvatuista (Kuva. S18), jossa peptidyyli-trnan vastaanottopää vuorovaikuttaa samanaikaisesti sekä A-että P-silmukoiden kanssa (kuva 4). Tässä tilassa C75: n ja A-silmukan g2553: n perusparannus säilyy, kun taas sen vastaanottajan varren siirtyminen lähelle klassisen P-sivuston tRNA: n asentoa mahdollistaa g2252: n ja G2253: n uudelleen järjestetyssä P-silmukassa yhteyden tRNA: n selkärankaan kohdissa 72 ja 70 (Kuva. 4b). Näin AP/ap-tRNA: n acceptorin varren pää ankkuroidaan P-silmukkaan, mikä helpottaa sen viereisten c74-ja C75-jäämien siirtymistä a-silmukasta P-silmukkaan. AP/ap tRNA: n A76 on suuntautunut samalla tavalla kuin p/p-klassisessa tilassa (17) sitoutuneen tRNA: n osalta, ja sen N-asetyylivaliinipeptidyyliosa on sijoitettu peptidin poistumistunnelin suulle, kun taas C74 ja C75 säilyttävät vuorovaikutuksensa 23S rRNA: N A-silmukan (Figs) kanssa. 4, S19).

ap/ap tRNA: n vastaanottopää yhtäaikaisesti koskettaa 23S rRNA: N A-ja P-silmukoita

translokaation aikana, peptidyyli-trnan 3′ – vastaanottopää siirtyy A) klassisen A/A: n tilasta B) välitilaan AP/ap: n tilaan C) klassisen P / P: n tiloihin konformaatiomuutosten helpottamana.

AP / ap-tRNA voi vastata kineettisesti luonnehdittuja välitiloja. Fluoresenssin sammuttavissa kineettisissä tutkimuksissa havaittiin EF-G: stä riippuvainen Välituote (INT), jossa peptidyyli-tRNA-kyynärpää siirtyy A-kohdasta kohti P-kohtaa, mutta pysyy vain osittain reaktiivisena aminoasyyli-tRNA-puromysiinin kanssa, mikä viittaa siihen, että sen cca-pää ei mahdu täysin P-kohtaan (28). Kineettisissä tutkimuksissa, joissa anturi kiinnitettiin suoraan peptidyyli-tRNA CCA-päähän, tunnistettiin EF-G-riippuvaista translokaatiovälitteitä, joissa peptidyyli-tRNA: n hyväksymispää liikkuu kohti P-kohtaa, mutta pysyy puromysiinillä reagoimattomana (29). Näiden välituotteiden ominaisuudet ovat yhteensopivia tässä havaitun AP/ap-tilan kanssa. Tämän vangitun translokaatiovälin rakenne alkaa kuvata sitä, miten Trna liikkuu ribosomaalisten A-ja P-paikkojen välillä. TRNA: n sidontapaikat itsessään ovat dynaamisia ja muodostavat yhtäaikaisia yhteyksiä A-tRNA: n ja sekä A-että P-paikkojen elementtien välille, mikä muistuttaa viestikapulan kulkemista viestijuoksussa (30). Tämä näkyy sekä 30-että 50-luvun alayksiköissä. 30S-alayksikössä 16S rRNA: n 966-silmukan uudelleenjärjestely vapauttaa G966: n P-sivuston ASL: stä ottamaan yhteyttä a-sivuston ASL: ään sen siirtyessä 30S P-sivustoon (Kuva. 2 E, F). 50S-alayksikössä 23S rRNA: N A-ja P-silmukat järjestyvät uudelleen, jotta molemmat silmukat voivat ottaa yhteyttä a-sivuston tRNA: n 3′ – acceptor-päähän, kun se alkaa siirtyä 50S P-sivustoon (Kuva. 4). Nämä havainnot osoittavat, että ribosomaalisen RNA: n rakenteellisella dynamiikalla on aktiivinen rooli translokaation mekanismissa.