Robert De Niro Sr. syntyi Syracusessa, New Yorkissa irlantilais-amerikkalaiselle äidille Helen M: lle (O ’ Reilly; 1899-1999). Helenin äiti oli Mary E. Burns (syntyjään John ja Mary Burns) ja isä Dennis Francis O ’Reilly, syntyjään Dundrumin Ellen Hall, Edward O’ Reillyn toinen vaimo. Dennisin äitiydestä oli aiemmin epäselvyyttä, sillä hänen äitiään luultiin aiemmin Edwardin toiseksi vaimoksi Margaretiksi.
Robertin amerikanitalialainen isä Henry Martin De Niro (1897-1976) syntyi Ferrazzanosta vuonna 1887 muuttaneille vanhemmille Angelina Mercuriolle ja Giovanni Di Nirolle.
Robert oli vanhin kolmesta lapsesta; hän ja sisarukset John ja Joan kasvoivat Syracusessa, New Yorkissa. De Niro opiskeli maineikkaassa Black Mountain Collegessa Josef Albersin johdolla vuosina 1939-1940. Vaikka Albersin erittäin analyyttinen lähestymistapa maalaustaiteeseen ei miellyttänyt De Niron vaistomaisempaa tyyliä, Bauhaus-mestarin kokemus ja kansainvälinen näkökulma jättivät kuitenkin lähtemättömän vaikutuksen. De Niro opiskeli Hans Hofmannin johdolla Provincetownissa, Massachusettsin kesäkoulussa. Hofmannin opetus abstraktista ekspressionismista ja Kubistisesta formalismista vaikutti voimakkaasti De Niron kehitykseen kypsänä taiteilijana.
Hofmannin kesäkoulussa hän tapasi opiskelutoverinsa Virginia Admiralin, jonka kanssa meni naimisiin vuonna 1942. Pariskunta muutti New Yorkin Greenwich Villagessa sijaitsevaan suureen, ilmavaan ullakkoasuntoon, jossa he pääsivät maalaamaan. He ympäröivät itsensä maineikkaalla ystäväpiirillä, johon kuuluivat kirjailijat Anaïs Nin ja Henry Miller, näytelmäkirjailija Tennessee Williams sekä näyttelijä ja kuuluisa berliiniläinen tanssija Valeska Gert. Admiral ja De Niro erosivat pian sen jälkeen, kun heidän poikansa Robert De Niro Jr.syntyi elokuussa 1943 De Niron tultua julki homona. Vuonna 1944 De Nirolla oli suhde runoilija Robert Duncanin kanssa.
opiskeltuaan Hans Hofmannin johdolla New Yorkissa sekä Provincetownissa ja Josef Albersin johdolla Black Mountain Collegessa Pohjois-Carolinassa 1930-luvun lopulla ja 1940-luvun alussa De Niro työskenteli viisi vuotta Hilla Rebayn legendaarisessa Museum of Non-Objective Artissa. Vuonna 1945 hän oli mukana Peggy Guggenheimin tämän vuosisadan Art of This Century-näyttelyssä New Yorkissa, joka oli johtava galleria sekä vakiintuneiden eurooppalaisten modernistien että nousevan abstraktin ekspressionistisen ryhmän jäsenten, kuten Jackson Pollockin, Mark Rothkon, Robert Motherwellin ja Clyfford Stillin taiteelle. De Nirolla oli ensimmäinen yksityisnäyttely Guggenheimin galleriassa seuraavan vuoden huhti-toukokuussa. Siinä vaiheessa hän työskenteli pääasiassa abstraktilla tavalla, usein kuvaannollisilla viittauksilla. Suuri osa hänen tältä ajalta peräisin olevista töistään menetettiin studiopalossa vuonna 1949.
De Nirolla oli 1950-luvulla sarja yksityisnäyttelyitä New Yorkin Charles Egan-galleriassa, jossa oli esillä Willem de Kooningin ja muiden varhaisten abstraktien ekspressionististen taiteilijoiden töitä. Kriitikot ylistivät DeNiron sävellyksiä, jotka olivat täynnä improvisoituja, värillisiä alueita, jotka väistyivät väljästi maalattujen asetelmien ja kurvikkaiden alastonkuvien tieltä. 1950-luvun puolivälissä De Niro oli säännöllisesti mukana tärkeissä ryhmänäyttelyissä, kuten The Whitney Annual, The Stable Annual ja The Jewish Museum. Hänelle myönnettiin Longview-säätiön palkinto vuonna 1958.
vuosina 1961-1964 De Niro matkusti Ranskaan maalaamaan Pariisiin ja sitä ympäröivälle maaseudulle. Keräilijä Joseph Hirshhorn osti useita taiteilijan maalauksia ja teoksia paperille tänä aikana kautta De Niron galleristi, Virginia Zabriskie, jotka ovat nyt pysyvässä kokoelmassa Hirshhorn Museum and Sculpture Garden Washington, DC. Vuonna 1968 hänelle myönnettiin Guggenheim-apuraha.