Dans les années 1970, la plupart des chromatographies en phase liquide ont été réalisées à l’aide d’une phase stationnaire de support solide (également appelée colonne) contenant des résines de silice ou d’alumine non modifiées. Ce type de technique est maintenant appelé chromatographie en phase normale. La phase stationnaire étant hydrophile dans cette technique, les molécules aux propriétés hydrophiles contenues dans la phase mobile auront une affinité élevée pour la phase stationnaire, et s’adsorberont donc sur le garnissage de la colonne. Les molécules hydrophobes ont moins d’affinité pour l’emballage de la colonne et passeront pour être éluées et détectées en premier. L’élution des molécules hydrophiles adsorbées sur le garnissage de colonne nécessite l’utilisation de solvants plus hydrophiles ou plus polaires en phase mobile pour déplacer la distribution des particules en phase stationnaire vers celle de la phase mobile.
La chromatographie en phase inversée est une technique utilisant des chaînes alkyles liées de manière covalente aux particules de phase stationnaire afin de créer une phase stationnaire hydrophobe, qui a une affinité plus forte pour les composés hydrophobes ou moins polaires. L’utilisation d’une phase stationnaire hydrophobe est essentiellement l’inverse de la chromatographie en phase normale, puisque la polarité des phases mobile et stationnaire a été inversée – d’où le terme de chromatographie en phase inversée. La chromatographie en phase inversée utilise une phase mobile polaire (aqueuse). En conséquence, les molécules hydrophobes de la phase mobile polaire ont tendance à s’adsorber sur la phase stationnaire hydrophobe, et les molécules hydrophiles de la phase mobile traverseront la colonne et seront éluées en premier. Les molécules hydrophobes peuvent être éluées de la colonne en diminuant la polarité de la phase mobile à l’aide d’un solvant organique (non polaire), ce qui réduit les interactions hydrophobes. Plus la molécule est hydrophobe, plus elle se liera fortement à la phase stationnaire et plus la concentration de solvant organique qui sera nécessaire pour éluer la molécule est élevée.
Bon nombre des considérations mathématiques et expérimentales utilisées dans d’autres méthodes chromatographiques s’appliquent également au RPC (par exemple, la résolution de séparation dépend de la longueur de la colonne). Il peut être utilisé pour la séparation d’une grande variété de molécules. Il n’est généralement pas utilisé pour la séparation des protéines, car les solvants organiques utilisés dans le RPC peuvent dénaturer de nombreuses protéines. Pour cette raison, la chromatographie en phase normale est plus couramment utilisée pour la séparation des protéines. Cependant, la dénaturation des protéines peut effectivement être bénéfique dans l’analyse ultérieure des échantillons obtenus à partir de la chromatographie. Si une digestion enzymatique par la trypsine est réalisée sur les protéines analysées, la protéine linéarisée convient mieux à cela. Par conséquent, la dénaturation des protéines à l’aide de solvants appropriés qui provoquent le déploiement des protéines peut en fait être intentionnelle avant de prélever l’échantillon fractionné par spectrométrie de masse.
Aujourd’hui, le CPR est une technique analytique fréquemment utilisée. Il existe une variété de phases stationnaires disponibles pour une utilisation en RPC, ce qui permet une grande flexibilité dans le développement de méthodes de séparation.
Phases stationnaires à base de silicemodifier
Toute substance polaire inerte qui atteint un emballage suffisant peut être utilisée pour la chromatographie en phase inversée. La colonne la plus populaire est une silice liée à une chaîne carbonée octadécyle (C18) (classification USP L1). Viennent ensuite la silice liée en C8 (L7), la silice pure (L3), la silice liée cyano (L10) et la silice liée phényle (L11). Notez que C18, C8 et phényle sont des résines dédiées à phase inversée, tandis que les colonnes cyano peuvent être utilisées en mode phase inversée en fonction des conditions de l’analyte et de la phase mobile. Toutes les colonnes C18 n’ont pas les mêmes propriétés de rétention. La fonctionnalisation de surface de la silice peut être réalisée dans une réaction monomère ou polymérique avec différents organosilanes à chaîne courte utilisés dans une deuxième étape pour couvrir les groupes silanol restants (coiffage final). Bien que le mécanisme de rétention global reste le même, des différences subtiles dans les chimies de surface des différentes phases stationnaires entraîneront des changements de sélectivité.
Les colonnes modernes ont une polarité différente. Le PFP est le pentafluorphényle. Le CN est cyano. NH2 est amino. ODS est octadécyle ou C18. L’ODCN est une colonne en mode mixte composée de C18 et de nitrile. SCX est un échange cationique fort (utilisé pour la séparation des amines organiques). SAX est un échange anionique fort (utilisé pour la séparation des composés d’acide carboxylique).