Effet du cholestérol sur la structure d’une bicouche phospholipidique

Mots-clés:

• biomembrane
• simulation moléculaire
• comportement de phase
• dimyristoylphosphatidylcholine
• modèle mésoscopique

Dans cet article, nous abordons une question thermodynamique apparemment simple: comment la surface par molécule d’une membrane de phospholipides change-t-elle si nous ajoutons du cholestérol? Cette question a été posée pour la première fois par Leathes (1) en 1925 et est toujours discutée aujourd’hui. L’importance de cette question est directement liée à l’importance du cholestérol pour le fonctionnement des membranes des eucaryotes supérieurs. Par exemple, le cholestérol régule la fluidité de la membrane et module la fonction des protéines membranaires (2). La compréhension de ces mécanismes a motivé de nombreux chercheurs à étudier en détail les interactions lipide–cholestérol. Parce qu’une membrane peut être considérée comme un liquide 2D, une première estimation de la façon dont la surface par molécule changerait lors de l’ajout de cholestérol supposerait un mélange idéal, où la surface par molécule est simplement une moyenne pondérée des zones de composants purs. En 1925, Leathes a montré qu’au lieu d’un mélange idéal, on observe un comportement non idéal frappant (1). Ce comportement non idéal est appelé effet de condensation (3) car la surface par molécule est beaucoup plus faible par rapport au mélange idéal. Comme une membrane se comporte comme un fluide incompressible, une diminution de la surface par molécule se traduira par une augmentation significative correspondante de l’épaisseur totale de la bicouche. Une telle augmentation de l’épaisseur signale une réorganisation de la structure de la membrane. Parce que les changements dans la structure de la membrane peuvent avoir des conséquences importantes sur le fonctionnement des protéines (2), il est important d’avoir une meilleure compréhension moléculaire des changements induits par le cholestérol.

Différents modèles conceptuels ont été proposés pour expliquer les interactions cholestérol-lipides non idéales. Les exemples incluent le modèle de complexes condensés (4, 5), le modèle de super-réseau (6) et le modèle parapluie (7). Le modèle des complexes condensés explique l’effet de condensation en supposant que le cholestérol induit la formation réversible d’un complexe cholestérol–lipides stoechiométrique. Dans un tel complexe, la membrane est condensée au fur et à mesure que les chaînes acyles lipidiques sont plus ordonnées. À une concentration de cholestérol donnée, il existe une composition d’équilibre entre ces complexes cholestérol-lipides condensés et les lipides ordinaires. Le modèle de super-réseau suppose qu’à des concentrations critiques, les molécules de cholestérol présentent un ordre spécifique à longue distance. Le modèle parapluie prend le point de vue que la partie hydrophile du cholestérol est trop petite et que les lipides doivent donc contribuer au criblage des molécules de cholestérol des interactions hydrophobes avec l’eau. Les phospholipides ne peuvent créer ce parapluie que si ces molécules se redressent pour laisser la place au cholestérol. Dans ces modèles, les mécanismes sous-jacents conduisant à la condensation sont très différents. Fait intéressant, une étude expérimentale récente a conclu que leurs données soutenaient le modèle des complexes condensés (8), alors qu’une autre série d’expériences n’a trouvé aucune indication des complexes condensés et a soutenu le modèle parapluie (9). Ces différences d’idées nous ont motivés à développer un modèle mésoscopique d’un système lipide–cholestérol–eau. Nous avons utilisé des simulations moléculaires pour mettre en lumière l’organisation latérale du cholestérol dans les membranes lipidiques et les interactions lipidiques–cholestérol sous-jacentes qui induisent l’effet de condensation.

Plusieurs simulations moléculaires de modèles tout-atomes et à gros grains de cholestérol dans des bicouches lipidiques ont été rapportées dans la littérature (pour quelques exemples récents, voir refs. 10 à 13 et leurs références). Idéalement, on aimerait utiliser des simulations tout atome pour étudier l’effet de condensation sur une large gamme de températures et de compositions. À l’heure actuelle, cependant, ces simulations prennent trop de temps. Par conséquent, nous utilisons un modèle à gros grains, dans lequel l’efficacité est acquise en intégrant certains des détails d’un modèle tout atome. Notre modèle est basé sur le modèle de Kranenburg et de ses collègues (14, 15). Le modèle utilise des molécules d’eau explicites. Les lipides et le cholestérol sont constitués de particules hydrophiles et hydrophobes (voir fig. 1). Ce modèle regroupe des groupes d’atomes en un pseudoatome mésoscopique. Les interactions intramoléculaires comprennent des vibrations de liaison et une flexion de liaison dont les paramètres ont été optimisés pour imiter la structure d’une seule molécule de phosphatidylcholine tout atome dans l’eau. Les interactions hydrophiles et hydrophobes sont décrites avec des interactions soft-répulsives, et les paramètres de ces interactions sont liés aux paramètres de solubilité en utilisant la méthode décrite par Groot et Rabone (16). L’idée de ce modèle est que les principales forces motrices du mélange cholestérol–phospholipides sont les interactions hydrophobes et hydrophiles, ce qui est la conclusion de nombreuses études expérimentales (7, 9, 17). Dans notre modèle, l’unité de longueur est directement liée à la taille effective d’un pseudoatome, c’est-à-dire qu’un pseudoatome occupe un volume de 90 Å3. L’unité d’énergie découle de l’adaptation des paramètres de répulsion douce des particules d’eau mésoscopiques à la compressibilité de l’eau aux conditions ambiantes. La simplicité des modèles nécessite une reparamétrisation de ces répulsions molles si la température est modifiée. Cependant, dans ce travail, nous supposons que les paramètres sont indépendants de la température. L’échelle de température est réglée en s’adaptant aux températures de transition de phase expérimentale. D’autres détails et applications de ce modèle peuvent être trouvés dans la réf. 18.

Notre modèle de cholestérol, illustré à la Fig. 1B, est basé sur les mêmes hypothèses sur la taille effective et les interactions que le modèle lipidique. Suivant McMullen et coll. (19), nous avons rendu la partie hydrophobe du modèle du cholestérol légèrement plus longue que la partie hydrophobe du modèle des lipides, qui vise à représenter la dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC). Pour simplifier, nous avons supposé que les interactions hydrophobes et hydrophiles d’une molécule de cholestérol sont similaires à celles d’un lipide. Pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire de l’effet de condensation du cholestérol, nous avons introduit trois molécules de type cholestérol dans lesquelles nous perturbons l’équilibre hydrophobe-hydrophile de la molécule: une dans laquelle nous diminuons la longueur de la queue hydrophobe (voir Fig. 1C), dans laquelle on ajoute un groupe hydrophobe supplémentaire (Fig. 1D), et une dans laquelle on remplace l’anneau par une simple chaîne (Fig. 1E).

Fig. 2 montre le diagramme de phase de composition en température calculée du système eau-phospholipides-cholestérol. Les limites de phase ont été obtenues à partir d’une inspection visuelle des instantanés et, plus quantitativement, à partir des points d’inflexion des courbes qui donnent l’aire par lipide, l’épaisseur hydrophobe moyenne de la membrane, ainsi que l’ordre de queue et les paramètres d’inclinaison. Ces propriétés ont été calculées en fonction de la température et de la teneur en cholestérol.

Concentrons-nous d’abord sur les phases lipidiques pures, et l’effet du cholestérol sera discuté ensuite. Pour la bicouche lipidique pure, le diagramme de phase a été calculé par Kranenburg et Smit(14) pour un système quatre fois plus petit. Nous avons utilisé la même méthodologie pour localiser les limites de phase que Kranenburg et Smit (14). Nos résultats sont en excellent accord avec cette étude, ce qui indique que les effets de taille finie sont faibles. Pour le phospholipide pur, on observe à haute température une phase liquide (La) dans laquelle les queues sont désordonnées. A basse température, les queues sont ordonnées et inclinées, ce qui définit la phase gel (L’c). Ces deux phases sont séparées par la phase ondulée (P’β), dans laquelle on observe une séparation microphasique des domaines dans lesquels la bicouche est épaisse et les lipides sont ordonnés et des domaines dans lesquels la bicouche est mince et les lipides désordonnés. La présence de ces trois phases indique que le diagramme de phase résultant est en très bon accord avec le diagramme expérimental du lipide pur (20). L’échelle de température est définie en faisant correspondre les températures des transitions de phase de la phase de gel à la phase d’ondulation (Tp) et de la phase d’ondulation à la phase liquide (Tm) avec les températures de transition de phase expérimentale correspondantes du DMPC pur. Une autre comparaison avec les données expérimentales est faite pour la surface moyenne par molécule de la bicouche (Fig. 3A), pour l’épaisseur de la bicouche (Fig. 4A), et pour l’ordre de la queue lipidique (Fig. 4B). Pour l’aire par lipide, nous obtenons 56 Å2 par molécule par rapport aux 60 Å2 expérimentaux (21) par molécule. Pour l’épaisseur de la bicouche, nous avons calculé une valeur de 38,7 Å, ce qui se compare bien à la valeur expérimentale de 36 Å (21), et un accord similaire est obtenu pour l’ordre de queue (voir Fig. 4B). Pour calculer l’aire par molécule pour le cholestérol pur, nous avons simulé une bicouche de cholestérol pur. Nous avons obtenu une valeur de 40,3 Å, ce qui se compare très bien à la valeur expérimentale la plus récente de 41 Å (22) pour une monocouche de cholestérol. Compte tenu des approximations faites dans notre modèle, l’accord entre les valeurs expérimentales et les valeurs simulées est étonnamment bon.

Passons maintenant à l’effet du cholestérol sur les propriétés de la bicouche. La première question que nous aborderons est de savoir si notre modèle peut reproduire l’effet de condensation. Figue. 3A montre l’effet du cholestérol sur la surface par molécule en fonction de la concentration en cholestérol. La comparaison avec les données expérimentales montre une fois de plus une très bonne concordance. Dans cette figure, nous montrons également l’aire par molécule en supposant un mélange idéal. Cette figure illustre de manière convaincante l’effet de condensation ; la surface par molécule diminue beaucoup plus que ce à quoi on pourrait s’attendre sur la base d’un mélange idéal. D’autres données expérimentales incluent l’effet du cholestérol sur le gonflement bicouche (Fig. 4A) et le paramètre d’ordre de queue (Fig. 4B). Les données expérimentales et la simulation montrent que le cholestérol augmente l’épaisseur de la bicouche et son ordre. Aussi pour ces deux propriétés, nos résultats de simulation sont en très bon accord avec les données expérimentales. Les données de simulation et expérimentales (fig. 3A et 4A et B) montrent que l’ajout de cholestérol modifie fortement les propriétés de la bicouche lipidique jusqu’à ±30% molaire de cholestérol. Après cela, une région est atteinte où l’ajout supplémentaire de cholestérol n’a qu’un léger effet. À 30% en moles de cholestérol, la surface par molécule et les paramètres d’ordre et d’inclinaison de la queue lipidique ont des valeurs typiques de la phase gel.

Le code couleur de la Fig. 2 montre la différence entre la surface simulée par lipide et la valeur estimée en supposant un mélange idéal. On observe qu’à haute et basse température, l’effet de condensation est relativement faible. L’effet de condensation est maximal dans une région bien définie de l’espace des phases située juste au-dessus de la transition de phase principale du phospholipide pur. Pour mieux comprendre la nature de l’effet de condensation, il est important de comprendre l’effet de l’ajout de cholestérol sur le comportement de phase de la membrane.

Fig. 2 montre les caractéristiques les plus importantes du diagramme de phase. Les différentes phases que nous avons observées dans nos simulations ont également été observées expérimentalement, mais pas toujours pour le mélange spécifique de DMPC et de cholestérol (20, 23, 24). Cependant, les différentes études expérimentales montrent des diagrammes de phase qualitativement très différents, ce qui limite nos possibilités de faire une comparaison détaillée. Des instantanés des différentes phases peuvent être trouvés à la Fig. 5.

À très haute température, l’ajout de jusqu’à 50% molaire de cholestérol a peu d’effet sur la structure de la membrane, et on observe la phase La pour toutes les concentrations (24). A des températures inférieures à Tp, on observe que le cholestérol modifie la structure de la phase gel en inhibant l’inclinaison des queues lipidiques, provoquant la formation de la phase L’c(20) (voir Fig. 5 D avec E). À des concentrations de cholestérol plus élevées (> 20%), nous observons la formation de petits amas riches en cholestérol. On désigne cette phase par LII, et cette phase est représentée à la Fig. 5E. À des températures comprises entre Tp et Tm, la bicouche pure est en phase d’ondulation, et le cholestérol transforme cette phase d’ondulation (voir Fig. 5C) dans une phase d’ordre liquide (23) (Fig. 5B). Le terme phase liquide ordonnée a été introduit par Ipsen et al. (25). L’épaisseur de la bicouche est intermédiaire entre l’épaisseur de la phase liquide et de la phase gel. Les paramètres d’ordre de queue des lipides ont des valeurs proches de la phase gel; cependant, contrairement à la phase gel, les lipides sont plus désordonnés et ne s’inclinent pas. Le cholestérol augmente progressivement la température à laquelle se produit la transition de phase La à Lo. À des concentrations de cholestérol très élevées, la phase liquide ordonnée se transforme en une phase gel (LII) lorsque la température est abaissée en dessous de Tm. Cette phase a été observée expérimentalement pour la dipalmitoylphosphatidylcholine (26), mais nous n’avons pas trouvé de données expérimentales pour le DMPC dans ces conditions. Revenons maintenant à l’effet de condensation. Figue. 2 montre que l’effet de condensation est maximal à une température juste au-dessus de la transition principale Tm. La raison en est que dans ces conditions, la bicouche pure est dans un état désordonné liquide, alors que l’ajout de cholestérol à la bicouche la transforme en une phase ordonnée liquide, qui a une surface par lipide beaucoup plus petite par rapport à l’état désordonné liquide. Cette grande différence provoque un effet de condensation important. À des températures plus élevées, la phase liquide reste stable pour toutes les concentrations de cholestérol, ce qui donne un effet de condensation beaucoup plus faible. À des températures plus basses, la bicouche lipidique pure a une surface par lipide beaucoup plus proche de la surface par lipide de la phase liquide ordonnée, et par conséquent l’effet de condensation est beaucoup moins important.

Les résultats ci-dessus indiquent que l’effet de condensation est une conséquence directe de changements particuliers du comportement de phase induits par le cholestérol. Dans la littérature, il existe diverses spéculations sur les aspects de la structure du cholestérol qui sont spécifiquement responsables de son effet de condensation. Par exemple, le modèle parapluie est basé sur l’idée que par rapport aux phospholipides, la partie hydrophile du cholestérol est beaucoup plus petite et nécessite le phospholipide, en tant que parapluie, pour un dépistage supplémentaire des interactions avec l’eau. Cela suggère qu’un groupe hydrophile supplémentaire modifierait complètement les propriétés. Un autre facteur important est la structure de l’anneau volumineux; si on remplace l’anneau par une queue on obtient une molécule qui ressemble plus à une molécule d’alcool (27). Cependant, raccourcir la queue hydrophobe aurait peu d’effet. Figue. 1 montre les molécules de cholestérol modifiées qui imitent ces changements. En effet, les résultats de la Fig. 3B montrent que le raccourcissement de la queue du cholestérol montre le même effet de condensation. Cependant, Fig. 3B montre que pour les deux autres modifications de la molécule de cholestérol, en ajoutant un groupe hydrophile supplémentaire et en remplaçant le cycle par une chaîne linéaire, aucun effet de condensation n’est observé. On observe l’effet inverse: l’ajout de ces molécules provoque une dilatation de la bicouche par rapport au mélange idéal. L’effet des alcools (plus petits) sur la surface par molécule a été mesuré expérimentalement, et les données expérimentales montrent également une augmentation (28). Étroitement lié à cela, nous avons observé que pour les deux cas dans le diagramme de phase, la phase liquide était stable sur toute la plage de concentration. En fait, nous observons que l’ajout de ces molécules diminue la température de transition principale, et donc il n’y a pas de région dans le diagramme de phase où il y a un effet de condensation important.

Les simulations avec ces variations structurelles du cholestérol indiquent à quel point le mécanisme est étonnamment subtil. La transition principale dans une bicouche pure est très sensible aux interactions hydrophobes. Les groupes de tête des lipides filtrent les queues hydrophobes de l’eau. À des températures élevées, la surface par lipide est élevée, et ce criblage est loin d’être optimal; mais dans ces conditions, l’entropie de la chaîne domine. La diminution de la température rend de plus en plus important le criblage des interactions hydrophobes et à la transition principale induit éventuellement un ordonnancement des chaînes. Un aspect clé est de comprendre comment le cholestérol déstabilise la phase liquide. Le cholestérol a une tête hydrophile plus petite et est donc moins efficace pour protéger les interactions hydrophobes. À des températures élevées, la bicouche lipidique peut s’en accommoder, mais à des températures plus basses, les lipides ne peuvent contribuer au criblage du cholestérol qu’en diminuant sa surface par lipide. Cela provoque l’ordre observé et explique pourquoi la transition principale augmente. Les deux changements que nous avons introduits dans la structure du cholestérol influencent son criblage hydrophobe; dans les deux variantes, la sous-dégradation intrinsèque du cholestérol disparaît. Si ces molécules sont ajoutées à la bicouche, il n’y a pas besoin de criblage supplémentaire des interactions hydrophobes, et ces molécules empêchent la formation d’une phase ordonnée.

Comparons nos observations avec les modèles précédents qui ont été introduits pour expliquer l’effet de condensation. Premièrement, notre modèle ne donne aucune indication de commande à longue portée comme le suppose le modèle de super-réseau. Implicitement dans le modèle parapluie et les complexes condensés est l’hypothèse d’une sorte d’organisation locale. Par exemple, dans le modèle parapluie, on suppose qu’une molécule lipidique pourrait filtrer une ou deux molécules de cholestérol voisines (voir par exemple, réf. 2). Nos simulations montrent une structure beaucoup plus désordonnée dans laquelle nous ne pouvons pas identifier ces structures ordonnées. À ce stade, il est important de rappeler que notre modèle contient de nombreuses hypothèses, ce qui soulève la question de savoir si les conclusions que nous tirons de nos simulations sont pertinentes pour les systèmes expérimentaux. Nous avons été très surpris de voir que nous avons pu obtenir un comportement de phase aussi riche en utilisant un modèle à gros grains qui utilise des forces purement répulsives. Notre modèle donne une description quantitative très raisonnable des données expérimentales récentes sur la structure de la bicouche. L’autre aspect intéressant est que nos calculs prédisent que l’effet de condensation est maximal dans une plage de température étroite au-dessus de la transition principale. Il pourrait être possible de le vérifier expérimentalement. Un test très rigoureux de notre modèle aurait été une comparaison détaillée avec le diagramme de phase expérimentale. Dans ce contexte, il est encourageant que les phases que nous avons trouvées aient été observées expérimentalement, mais pas toujours pour exactement le système simulé. En sélectionnant soigneusement les données expérimentales qui concordent avec nos simulations, nous pourrions même prétendre à un très bon accord. Une raison possible du désaccord entre les différentes expériences est que différentes techniques sont utilisées et que toutes les techniques ne sont pas également sensibles aux différences de structure des différentes phases. Nous espérons que la combinaison d’un diagramme de phase et d’informations détaillées sur la structure des différentes phases donnera des lignes directrices pour savoir si une technique expérimentale particulière peut identifier une transition de phase particulière.