Toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux directives et règlements pertinents. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets.
Matériau
Les pansements argentés suivants ont été comparés : Acticoat (Smith &Nephew, UK; désigné dans cet article comme Ac), Aquacel Ag+ Extra (Convatec, UK; désigné dans cet article comme Aq), Silvercel Hydro-Alginate (Systagenix, UK; (CI-après dénommé dans le présent article Sc), et Ialugen Plus (CI-après dénommé dans le présent article Ia).
D’autres produits chimiques ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, États-Unis), sauf indication contraire.
Préparation d’extraits
Dans plusieurs dosages, des extraits de pansements ont été utilisés plutôt que les pansements eux-mêmes. Ces extraits ont été préparés à l’aide d’une solution saline physiologique (NaCl à 0,9 % (p/v)) ou de milieux de culture cellulaire additionnés de sérum foetal bovin (FBS) à 10 %. Le rapport de la zone de pansement à la solution était de 1 cm2 pour 4 mL de solution. L’extraction a été effectuée pendant 72 h à TA sous agitation constante. Les extraits ont été stérilisés en les passant à travers un filtre de 0,2 µm et conservés à 4 °C jusqu’à utilisation.
Mesure de la concentration d’argent
Les concentrations d’argent dans les pansements et les extraits de pansements ont été mesurées à l’aide de l’ICP-OES. La concentration en argent a également été évaluée dans des échantillons de peau porcins ex vivo. 10 à 70 mg de chaque échantillon ont été transférés dans un récipient en PTFE pour une digestion par micro-ondes. Ensuite, 1 mL d’acide nitrique concentré (grade d’analyse des traces, Analytika Ltd., République tchèque), 0.8 mL d’acide chlorhydrique concentré (grade d’analyse des traces, Analytika Ltd., République tchèque) et 0,2 mL de peroxyde d’hydrogène (p.a. 30%, Penta Ltd., République tchèque) ont été ajoutés. L’échantillon a été digéré à 150 °C pendant 5 min puis, dans la deuxième étape du même cycle, à 200 °C pendant 10 min. Après digestion, l’échantillon a été transféré quantitativement à l’aide de 0,2 mL de peroxyde d’hydrogène et d’eau désionisée.
L’analyse a été réalisée avec un instrument ICP-OES (Radial 725, Agilent Technologies, Australie) équipé d’un nébuliseur pneumatique de pulvérisation marine et d’une chambre de pulvérisation cyclonique. La quantification était basée sur un étalonnage externe. La précision et la fiabilité de la méthode ont été testées à l’aide d’échantillons de peau porcine enrichis de concentrations connues d’Ag provenant d’une solution de référence certifiée (Analytika Ltd., tch).
Microscopie électronique à balayage
Des analyses en microscopie électronique à balayage (MEB) ont été effectuées à l’aide d’un instrument Zeiss Ultra Plus (Zeiss, Allemagne). Les échantillons ont été enrobés d’une fine couche d’Au/Pd dans une enduiseuse à pulvérisation cathodique Quorum SC7620. Les images ont été prises par deux détecteurs d’électrons InLens et SE2 secondaires pour un grossissement plus ou moins élevé, respectivement. Les paramètres de balayage étaient les suivants: tension d’accélération, 3,5 kV; courant de sonde, 36 pA; et pression dans la chambre, ~ 7 × 10-5 Pa.
Les images EDX ont été capturées avec l’instrument Zeiss Ultra Plus. Des cartes et des spectres de rayons X ont été pris par un détecteur de rayons X X-MaxN 80 (Oxford Instruments, Royaume-Uni). Les paramètres EDX étaient les suivants: tension d’accélération, 10 kV; courant de sonde, 300 pA; distance de travail, 8,5 mm; et temps de traitement, 4.
Activité oxydante directe des pansements
La génération de ROS dans des conditions sans cellules a été évaluée en utilisant la 3,3′,5,5′-tétraméthyl-benzidine (TMB) comme substrat pour la peroxydase de raifort (HRP). Des cercles de diamètre 6 mm ont été découpés dans les pansements et testés. Brièvement, la solution de travail était constituée de TMB 0,1 mg / mL (solution mère c = 1 mg / mL dans le DMSO) mélangée 1: 9 avec du tampon citrate–phosphate 0,05 M (pH = 5) et de HRP (c final = 0,16 UI/ mL). Chaque morceau de pansement a été immergé dans 0,5 mL de la solution de travail et des échantillons (25 µL) ont été prélevés à 0, 5, 7,5 et 10 min. Immédiatement après la collecte, les échantillons ont été mélangés dans un rapport de 1: 1 avec 0,16 M de H2SO4 et l’absorbance a été lue à 450 nm (longueur d’onde de référence = 540 nm) à l’aide d’un instrument NanoDrop OneC (ThermoFisher Scientific, US). 30% de H2O2 a été utilisé comme témoin positif. Le signal de fond (solution vide) a été soustrait.
Pénétration de l’argent dans la peau dé-épithélialisée
Nous avons utilisé des cellules de Franz à diffusion statique pour étudier la pénétration de l’argent dans la peau dé-épithélialisée. La peau a été obtenue dans un abattoir local (Bocus, Letohrad, République tchèque) et excisée de la partie interne de l’oreillette porcine. Les cheveux ont été rasés, la peau a été incubée dans du PBS (60 ° C, 90 s) et l’épiderme a été décollé. L’épaisseur moyenne de la peau dé-épithélialisée était de 2 mm. Les morceaux de peau ont été placés dans une chambre et recouverts d’un pansement argenté testé ou d’un morceau de gaze. Chaque chambre donneuse a été remplie de 0,3 mL de milieu de culture NHDF avec 10% de FBS. La chambre acceptrice contient 0,7 mL de milieu de culture. Les cellules de diffusion ont été incubées à 37 °C pendant 24 ou 48 h. Après incubation, la peau a été rincée avec du PBS, et les parties de la peau qui séparaient les chambres donneur et accepteur ont été analysées pour la teneur en argent à l’aide d’ICP-OES, comme décrit ci-dessus. La quantité d’argent qui a pénétré à travers la peau dé-épithélialisée a été mesurée dans le liquide donneur. Trois répliques indépendantes ont été préparées aux deux moments.
Culture de la peau ex vivo avec des pansements
Les oreillettes porcines fraîches (Bocus) (1-2 h) ont été soigneusement nettoyées avec du savon et de la Bétadine (une solution d’iode PVP, Egis Pharma, Hongrie) et rincées à l’eau. Les morceaux de peau (1 × 1 cm) des oreillettes ont été excisés et placés dans une solution antibiotique (solution pénicilline–streptomycine, 10 000 U /mL de pénicilline, 10 mg /mL de streptomycine) pendant 30 min à 37 ° C sous O2 et CO2 atmosphériques. Des échantillons de peau à épiderme intact ont été placés côté dermique vers le haut dans des plaques de culture à 6 puits avec 3 mL de milieu NHDF additionné de FBS à 10%, puis recouverts de 1 × 1 cm de pansement contenant de l’argent sélectionné ou de gaze témoin stérile imbibée de 300 µl de milieu de culture. Les échantillons ont été incubés pendant 24 ou 48 h. Ensuite, la peau a été rincée avec du PBS et chacun des explants cutanés a été divisé en tiers pour examen histologique (fixation de 4% de PFA à 4 ° C), analyse des protéines par Western blot (congélation instantanée à l’azote liquide), et qPCR (nuit au RNAlater (Thermo Fisher Scientific), puis à − 80 ° C).
Coloration histologique
La coloration autométallographique de l’argent a été adoptée selon Danscher et al.49. Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope Eclipse 50i avec un appareil photo DS-Fi1 (Nikon, Yokohama-Shi, Japon).
Pour l’immunofluorescence de yH2AX, des coupes histologiques sur des lames de verre Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ont été deparaffinisées et incubées pendant une nuit avec un anticorps primaire (1:1 000, ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, clone JBW301, Millipore, MA, USA). Ils ont ensuite été incubés pendant 1 h avec un anticorps secondaire (ab150114, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni; dilution 1:10 000) et montés sur des lames avec un agent Antifade au Diamant Prolongateur avec du DAPI (ThermoFisher Scientific). Les images ont été capturées avec un microscope fluorescent Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japon).
Expression du gène
La peau porcine après incubation avec des pansements a été traitée pour l’isolement de l’ARN, la synthèse de l’ADNc et l’expression du gène qPCR comme décrit précédemment par Klein et al.50 tests de PCR en temps réel TaqMan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) utilisés pour qPCR étaient les suivants : DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. Les valeurs du cycle seuil ont été normalisées avec le gène d’entretien ménager RPL13A et liées à des échantillons témoins de gaze pour le temps particulier (intervalle de 24 ou 48 h) en utilisant la méthode 2-δδct51. Six échantillons indépendants pour chaque traitement et chaque période ont été mesurés et moyennés. La signification des différences d’expression génique par rapport au contrôle de la gaze a été évaluée à l’aide du test t de Student pour chaque pansement à l’argent dans le temps spécifié.
Western blot
Pour une analyse ultérieure de Western blot, des lysats de tissus ont été préparés à partir de peau de porc congelée. Utilisation d’un scalpel dans une goutte de tampon de lyse (50 mm de Tris pH 8; 150 mm de NaCl; 1% de Triton X-100; 0,5% de désoxycholate de sodium; 1% de dodécylsulfate de sodium; 4% d’urée), la peau a été découpée en petits morceaux, qui ont ensuite été homogénéisés dans 350 µl du tampon de lyse à l’aide d’un cordon en acier inoxydable de 5 mm et d’un homogénéisateur tissulaire (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Allemagne) pendant 10 min à 25 Hz. La concentration en protéines a été mesurée au moyen du kit de dosage des protéines BCA (Thermo Fisher Scientific).
Les protéines des lysats ont été séparées à l’aide d’un gradient SDS-PAGE de 4 à 15% et transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène. Pour détecter des protéines spécifiques, les membranes ont été incubées pendant une nuit dans un tampon bloquant (Tris 20 mm; NaCl 137 mm; Tween 20 0,05%; poudre de lait faible en gras séchée à 5%) avec l’anticorps primaire phospho-histone H2A.X (20E3) (1: 1 000; Signalisation cellulaire, États-Unis). la β-actine a été utilisée comme contrôle du chargement de la quantité de protéines (1:2000; Santa Cruz, États-Unis). Les membranes ont été développées avec des Ig anti-lapin ou anti-souris conjuguées HRP en utilisant une détection chimiluminescente pour visualiser les signaux (substrat Clarity Western ECL; Bio-Rad, États-Unis). Les signaux ont été analysés et évalués avec un système d’imagerie par chimiluminescence Chroma Alliance 9.7 (UVItec Limited, Royaume-Uni).
Activité antibactérienne
La méthode de diffusion sur gélose a été utilisée pour comparer les activités antimicrobiennes des pansements. Un échantillon (1 cm2) de chaque pansement a été incubé sur une boîte de Pétri fraîchement inoculée avec soit Staphylococcus aureus, soit Pseudomonas aeruginosa; ces souches ont été isolées de plaies chroniques humaines, caractérisées et cultivées comme décrit précédemment 52. De plus, l’efficacité antimicrobienne des extraits de pansement (préparés en milieu RPMI à 10% de FBS, comme décrit ci-dessus) a été comparée au moyen de la méthode de microdilution 53. La densité optique a été mesurée par un lecteur de plaques multimode Ensight (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) à 600 nm pendant 24 h (agitation, 37 °C).
Culture cellulaire
Des fibroblastes cutanés humains normaux provenant de peau adulte (NHDF) ont été achetés à Lonza (Bâle, Suisse). Les NHDF ont été cultivés dans le milieu à faible teneur en glucose modifié Eagles (DMEM) de Dulbecco additionné de FBS à 10%, de glutamine (0,3 mg/mL), de glucose (4 mg/mL), de pénicilline (100 unités/mL) et de streptomycine (0,1 mg/mL) dans des flacons de culture de 75 cm2 sous 5% de CO2 et à 37 °C jusqu’au cinquième passage. Les kératinocytes HaCaT ont été achetés chez Hölzel Diagnostika (Köln, Allemagne) et ont été cultivés de la même manière mais sans ajout de glucose dans le milieu.
Mesure de viabilité
Cinq mille cellules par puits ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits avec 200 µL du milieu de culture avec 10% de FBS dans un incubateur (37 °C, 5% de CO2) pendant la nuit. Le lendemain, les cellules ont été traitées avec 200 µL d’une série de dilutions d’extraits des pansements (100%, 50%, 20%, soit 10% de l’extrait d’origine dilué avec du milieu de culture additionné de 10% de FBS) pendant 24, 48 et 72 h. Les cellules témoins ont été traitées avec un milieu de culture standard à 10% de FBS. La viabilité a été mesurée comme décrit précédemment 54 à l’aide du dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-tétrazolium (MTT). Une solution mère de MTT (20 µL; c = 5 mg/mL) a été ajoutée au milieu de culture cellulaire dans chaque puits. Les plaques ont été incubées pendant 2,5 h à 37 °C. Puis, la solution de MTT a été retirée, 220 µL de solution de lyse (propan-2-ol 1:1 avec du DMSO, Triton X-100 à 10% (p/v) et HCl à 0,37% (p/v) ont été ajoutés et la lyse a été effectuée pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur rotatif (150 tr/min). L’absorbance a été lue à 570 et 690 nm avec un lecteur de plaques multimode EnSight (PerkinElmer, USA). Les données ont été traitées à Kaleido (PerkinElmer, États-Unis). L’absorbance finale a été calculée comme A = A570-A690. Le changement de viabilité des cellules traitées par rapport aux cellules témoins a été calculé comme changement = (Un échantillon / Un témoin – 1) × 100.
Essai d’inhibition par contact direct
Des cellules ont été ensemencées à une densité de 300 000 cellules par puits dans une plaque à 6 puits et incubées dans le milieu de culture additionné de 10% de FBS à 37 °C et sous 5% de CO2 jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Les pansements ont été coupés en carrés de 1 cm2, placés sur la couche cellulaire et incubés avec le milieu de culture standard pendant 6 h. Les cellules témoins ont été traitées uniquement avec le milieu. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS et fixées avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 min. Les cellules ont été colorées avec une solution cristalline violette à 0,1% (p/v) (dissoute dans de l’éthanol à 10%) pendant une heure puis rincées à l’eau. Les zones d’inhibition ont été photographiées à l’aide d’un appareil photo numérique Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f (Canon).
Coloration fluorescente des cellules
Pour l’analyse des dommages à l’ADN, les cellules NHDF ont été ensemencées sur des lames microscopiques dans une plaque à 6 puits à une densité de 2 × 105 par puits et laissées adhérer pendant une nuit. Le lendemain, les cellules ont été traitées avec des extraits de pansement dilués 5 × et incubées pendant 24 h. Par la suite, les cellules ont été fixées à l’aide de PFA à 4% pendant 15 min. Après perméabilisation et blocage, les lames ont été incubées avec un anticorps primaire de lapin anti-yH2AX (Signalisation cellulaire, US ; dilution 1:500 dans un tampon bloquant – 20% de FBS, 0,3 M de glycine, 0,05% de Tween 20 dans le PBS ; pendant la nuit ; 4 °C). La détection a été réalisée à l’aide d’un anticorps secondaire marqué avec Alexa Fluor 555 (Abcam, Royaume-Uni; 1:500 dans un tampon de blocage; 1 h, RT). Les glissières ont été montées à l’aide d’un Antifade Diamanté Prolongateur avec DAPI (ThermoFisher Scientific). Après séchage des lames, des images ont été prises à l’aide d’un microscope fluorescent Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japon).
Le stress oxydatif intracellulaire a été détecté à l’aide d’une sonde DCF-DA, qui est sensible à la concentration globale de ROS à l’intérieur des cellules. Les cellules ont été ensemencées pendant une nuit dans une plaque à 24 puits puis marquées avec du DCF-DA (1 µg / mL) pendant 15 min, après quoi elles ont été traitées avec des extraits de pansement dilués 5 × et incubées à 37 ° C et sous 5% de CO2. 5 mm H2O2 ont été utilisés comme témoin positif. La fluorescence verte du DCF a été enregistrée toutes les 15 min pendant une période d’incubation de 90 min à l’aide d’un microscope automatisé Incucyte S3 (Essen Bioscience, USA). La quantification de la fluorescence intracellulaire a été réalisée dans un logiciel Fiji suivant la méthode décrite par Čepa55.
Détermination de l’éclatement oxydatif par les neutrophiles dans le sang total
Un comité d’éthique indépendant a approuvé la collecte d’échantillons de sang pour le dosage de l’éclatement oxydatif des neutrophiles et le MAT (Comité d’éthique pour la recherche à l’Université Masaryk, Brno, Tchéquie, approbation no. EKV-2018-083). Tous les donateurs ont donné leur consentement écrit.
Le sursaut oxydatif (production de ROS) des phagocytes sanguins a été déterminé dans du sang total dilué par chimioluminescence (CL) améliorée au luminol à l’aide d’un luminomètre sur microplaque LM-01T (Immunotech, République tchèque). Brièvement, le mélange réactionnel est constitué de 6 µL de sang total dans 54 µl de milieu de croissance RPMI-1640 mélangé à 60 µl d’extrait de pansement dans une solution saline physiologique ou un milieu complété par du FBS. Ce mélange a été incubé à 37 °C pendant 20 min. Juste avant le début de la mesure, nous avons ajouté du luminol de 1 mM (une solution mère de luminol de 10 mM dans un tampon borate de 0,2 M) (Molecular Probes, USA). Nous avons déterminé la production spontanée de ROS et la production de ROS induite par des particules de zymosane opsonisées (OZP—0,1 mg/mL) (Sigma-Aldrich, États-Unis) ou de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA-0,8 µM; Sigma-Aldrich, États-Unis). Les échantillons non traités sans les extraits testés ont été évalués comme témoins. Les essais ont été effectués en doublons. La chimiluminescence a été enregistrée en continu pendant 90 min à 37 °C et a été exprimée en unités de lumière relative (RLU). Nous avons déterminé la quantité totale de production de ROS à partir de la zone intégrée sous la courbe de chimiluminescence.
Le test d’activation des monocytes (MAT)
MAT a été réalisé dans du sang total humain héparinisé dilué dans une solution saline de 10 ×. Des échantillons de sang ont été prélevés sur cinq donneurs sains, mis en commun et dilués avec une solution saline. Les échantillons de sang dilués ont été incubés avec des cercles de 6 mm de diamètre découpés dans des pansements dans des microtubes stériles pendant 24 h à 37 °C En parallèle, lipopolysaccharide (LPS, final c = 0. 25 UI / mL; E-Toxate standard d’endotoxine; Sigma, États-Unis) a été ajouté à la deuxième série d’échantillons incubés avec des échantillons de pansement pour stimuler une réponse immunitaire innée aux bactéries. Les cellules sanguines se sont sédimentées pendant l’incubation, laissant une phase supérieure de plasma dilué en solution saline. Après incubation, 200 µL de chaque échantillon de plasma dilué dans une solution saline ont été collectés et immédiatement dosés en double pour l’IL-6 à l’aide d’un kit ELISA Humain Non couché IL-6 selon le protocole du fabricant (ThermoFisher Scientific, US). L’absorbance a été lue à l’aide d’un lecteur de plaques multimode EnSight (PerkinElmer, US) et la concentration finale en IL-6 a été calculée par Kaleido SW (Perkin Elmer, US). Le plasma restant et les cellules sédimentées ont été stockés à 4 ° C pour l’évaluation de l’hémolyse et de la toxicité.
Hémolyse
Une hémolyse a été détectée dans le reste du plasma dilué en solution saline et dans les cellules sédimentées du MAT. Après centrifugation, 100 µL de chaque échantillon ont été transférés sur une microplaque à 96 puits et l’absorbance a été mesurée à 550 nm. 1% de Triton X-100 a été utilisé comme témoin positif.
Libération de LDH
Les toxicités des pansements d’argent sur les cellules sanguines ont été évaluées au moyen d’un dosage de la lactate déshydrogénase (LDH) (Cytotoxicity Detection KitPLUS, Roche, Suisse) selon les instructions du fabricant. Deux sources de cellules sanguines ont été utilisées— du sang total humain incubé avec des pansements d’argent comme dans le MAT et des neutrophiles isolés. L’absorbance utilisée pour la correction du fond a été mesurée dans des échantillons vierges sans réactif LDH. Les résultats sont rapportés en valeurs absolues de densité optique par rapport à un échantillon non traité.
Analyse statistique
Sauf indication contraire, le test t de Student a été utilisé pour évaluer la signification statistique des différences entre les échantillons et les témoins non traités.