Introduction
Kcat est le numéro de rotation — le nombre de molécules de substrat que chaque site d’enzyme convertit en produit par unité de temps. Si vous connaissez la concentration des sites enzymatiques, vous pouvez ajuster Kcat au lieu de Vmax lors de l’analyse d’une courbe substrat/vitesse.
Le modèle
Y=Et*kcat*X/(Km+X)
X est la concentration du substrat.
Y est la vitesse de l’enzyme.
kcat est le numéro de rotation, le nombre de fois que chaque site enzymatique convertit le substrat en produit par unité de temps. Ceci est exprimé dans l’inverse des unités de temps de l’axe des ordonnées. Par example, si Y est en micromoles de substrat par minute, alors kcat est le nombre de molécules de substrat produites par site catalytique par minute.
Km est la constante de Michaelis-Menten, dans les mêmes unités que X. C’est la concentration de substrat nécessaire pour atteindre une vitesse d’enzyme demi-maximale.
Et est la concentration des sites catalytiques enzymatiques. Si l’enzyme a plusieurs sous-unités, notez que Et est la concentration de sites catalytiques, qui peut être plus grande que la concentration de molécules d’enzymes. Les valeurs Y que vous entrez sont la vitesse de l’enzyme saisie en unités de concentration par temps. Et doit être entré dans ces mêmes unités de concentration (alors que les unités de temps sont définies par kcat).
Vmax est la vitesse maximale de l’enzyme dans les mêmes unités que Y. Elle n’est pas directement indiquée dans le modèle ci-dessus. C’est la vitesse de l’enzyme extrapolée à des concentrations très élevées de substrat, elle est donc presque toujours supérieure à n’importe quelle vitesse mesurée dans votre expérience. Il est calculé en multipliant Et fois kcat.
Relation avec le modèle de Michaelis-Menten
La courbe ci-dessus est identique à la courbe définie par le modèle de Michaelis-Menten. Vous obtiendrez des courbes identiques lorsque vous ajusterez l’un ou l’autre modèle à vos données et des valeurs identiques pour Km.
Le modèle de Michaelis-Menten trouve la Vmax, qui est la vitesse maximale de l’enzyme extrapolée à des concentrations très élevées de substrat. Il est exprimé dans les mêmes unités que celles utilisées pour entrer vos valeurs Y (activité enzymatique). Habituellement, il est simple d’exprimer cela (ou de le convertir en) moles / minute / mg de protéines. Le Vmax est déterminé par le nombre de sites enzymatiques présents (Et) et la vitesse à laquelle l’enzyme peut convertir le substrat en produit (kcat).
Si vous connaissez la concentration des sites enzymatiques que vous avez ajoutés au test (Et), vous pouvez ajuster la constante catalytique Kcat en utilisant le modèle ci-dessus.
Lors du calcul de Kcat, les unités de concentration s’annulent, de sorte que Kcat est exprimé en unités de temps inverse. C’est le chiffre d’affaires the le nombre de molécules de substrat que chaque site d’enzyme convertit en produit par unité de temps.
Montage du modèle avec Prisme
1.Créez une table de données XY. Entrez la concentration du substrat dans X et la vitesse de l’enzyme dans Y. Si vous avez plusieurs conditions expérimentales, placez la première dans la colonne A, la seconde dans la colonne B, etc. Vous pouvez également choisir les données d’échantillon de Prism: cinétique enzymatique Micha Michaelis-Menten.
2.Après avoir entré les données, cliquez sur Analyser, choisissez Régression non linéaire, choisissez le panneau d’équations cinétiques enzymatiques et choisissez Kcat.
3.Vous devez contraindre Et à une valeur constante, basée sur d’autres expériences. Pour contraindre la valeur de Et, allez dans l’onglet Contrainte de la boîte de dialogue de régression non linéaire, assurez-vous que la liste déroulante à côté de Et est définie sur « Constante égale à » et entrez la valeur. Pour les données d’échantillon, entrez 100 comme valeur de Et.
Si vous ne connaissez pas la valeur de Et, vous ne pouvez pas adapter le kcat, mais devrait plutôt correspondre au Vmax. Il n’est pas possible pour Prism de s’adapter à la fois au kcat et à l’Et, car les deux paramètres sont entrelacés, et une courbe substrat-vitesse ne donne aucune information sur leurs valeurs individuelles.
4.Avec les données d’échantillon, Prism indique que Km = 5,886 avec un intervalle de confiance à 95% allant de 3,933 à 7,839. La meilleure valeur d’ajustement de kcat est de 13,53 avec un intervalle de confiance à 95% allant de 11,97 à 15,09.
Notes
* Voir la liste des hypothèses de toutes les analyses de cinétique enzymatique.
* Cette équation correspond exactement à la même courbe que l’équation qui correspond à Vmax, plutôt qu’au numéro de chiffre d’affaires Kcat. Le produit de Kcat fois Et (la concentration des sites enzymatiques) est égal au Vmax.
* Cette équation est liée à l’équation des enzymes allostériques. Ce modèle allostérique ajoute un paramètre supplémentaire : la pente de la colline h. Lorsque h est égal à 1,0, les deux modèles sont identiques.