Il y a souvent beaucoup de confusion sur la signification des « unités enzymatiques », « activité enzymatique » et « activité enzymatique spécifique ». Ce guide explique ces concepts clés en termes simples et discute de la conception des tests enzymatiques et de l’importance de fonctionner dans la « gamme linéaire ». Nous considérons également les courbes standard et si vous devez tracer la concentration ou la quantité absolue de produit sur l’axe des abscisses. Quelques conseils sur la configuration des contrôles d’analyse et la soustraction des blancs sont discutés. Enfin, nous expliquons comment les valeurs d’activité enzymatique sont calculées et nous donnons un aperçu simple des équations cinétiques.
Définitions des unités enzymatiques
L’enzymologie serait moins compliquée si tout le monde utilisait la même définition d’unités. Une définition unitaire standard est donnée ci-dessous :
1 unité (U) est la quantité d’enzyme qui catalyse la réaction de 1 umol de substrat par minute (définition A).
Dans la plupart des paramètres R &D, 1 umol de substrat est en fait beaucoup de matériau et d’autres définitions peuvent être préférées pour éviter d’exprimer des quantités en fractions d’unités. La définition non standard suivante est couramment utilisée:
1 unité (U) est la quantité d’enzyme qui catalyse la réaction de 1 nmol de substrat par minute (définition B).
Notez que le changement de définition a un effet profond sur le nombre d’unités indiqué, c’est-à-dire qu’une unité d’enzyme selon la définition A équivaudrait à 1000 unités selon la définition B !
Vous pouvez également voir des unités enzymatiques exprimées en milli-unité (ou mU), ce qui signifie simplement un millième d’unité, quelle que soit la façon dont l’unité a été définie.
Il est clair que la quantité réelle d’une enzyme dans un tube n’est pas modifiée simplement en modifiant la définition de l’unité, mais il faut faire preuve de prudence lors de la comparaison des activités des échantillons provenant de différents fournisseurs. Tant que les définitions d’unités sont fournies, vous pouvez transformer le nombre d’unités indiqué en nmol par minute, ce qui est sans ambiguïté et permet d’effectuer des comparaisons valides.
Pour plus de clarté dans votre propre travail, vous préférerez peut-être utiliser ‘nmol par min’ (ou ‘umol par min’), bien que si une répétition constante est nécessaire, le terme beaucoup plus court ‘unité’ a clairement ses attraits.
Qu’est-ce qu’une « Activité enzymatique »
L’activité est indiquée en unités par ml (U/ml), c’est-à-dire en nmol par min et par ml (si la définition de l’unité B a été adoptée). Ainsi, les valeurs d’activité exprimées en unités sont également sujettes à une « augmentation » illusoire de 1000 fois si l’on passe de la définition d’unité A à la définition d’unité B. Encore une fois, il ne peut y avoir de confusion si l’activité est exprimée en termes de nmol par minute et par ml plutôt qu’en unités par ml.
Comme l’activité est liée à la concentration, il s’ensuit que deux flacons d’enzyme peuvent contenir le même nombre d’unités (au total) mais avoir des activités (concentrations) différentes.
Qu’Est-Ce Que L’Activité Enzymatique Spécifique ?
L’activité enzymatique spécifique (généralement appelée simplement « activité spécifique ») est le nombre d’unités enzymatiques par ml divisé par la concentration de protéines en mg/ml. Les valeurs d’activité spécifiques sont donc indiquées en unités/mg ou nmol/min/mg (si la définition d’unité B est appliquée).
L’activité spécifique est une mesure importante de la pureté de l’enzyme et les valeurs pour différents lots d’une enzyme pure doivent être les mêmes, dans les limites de l’erreur expérimentale normale.
Les dilutions en série d’une solution enzymatique auront des valeurs d’activité enzymatique différentes, mais des valeurs d’activité spécifique identiques car, lors du calcul de l’activité spécifique, le numérateur (unités/ ml) et le dénominateur (mg / ml) sont également affectés par la dilution de l’échantillon.
Bien que l’activité spécifique soit très différente de l’activité, le calcul de l’activité spécifique dépend néanmoins de la valeur d’activité et, par conséquent, la valeur d’activité spécifique indiquée dépendra également de la définition de l’unité enzymatique. Les lots inférieurs à la valeur d’activité spécifique attendue peuvent contenir des impuretés ou des molécules enzymatiques dénaturées.
Facteurs affectant l’activité enzymatique
Dans cette section, nous expliquons pourquoi une enzyme peut avoir des valeurs d’activité mesurées différentes dans différents laboratoires. Nous entendons par là des différences réelles dans l’activité mesurée, et non des différences apparentes causées par l’utilisation de différentes définitions d’unités.
Les conditions dans lesquelles un dosage est effectué influenceront les valeurs d’activité rapportées. Par example, les dosages sont typiquement réalisés à une température comprise entre 20 et 37°C. D’une manière générale, une enzyme sera plus active à 37°C qu’à 20°C.
La définition de l’unité enzymatique serait mieux exprimée ainsi :
1 unité (U) est la quantité d’enzyme if qui catalyse la réaction de 1 nmol de substrat par minute dans des conditions standard.
Malheureusement, le terme « conditions standard » peut être interprété et il peut y avoir différentes préférences de l’utilisateur, au moins dans les environnements R&D. Ainsi, dix laboratoires de recherche différents peuvent (très correctement) calculer différentes activités pour la même solution d’enzyme. La plupart des laboratoires de recherche établissent leurs propres « conditions standard » et vérifient chaque nouveau lot en interne. Dans les milieux cliniques, les « conditions standard » sont explicitement définies et tous les laboratoires sont tenus d’effectuer des dosages identiques.
Développement de tests et importance de la plage linéaire
La valeur d’activité (unités/ ml) de votre enzyme est le paramètre le plus important lorsque vous développez un test. En effet, le volume (c’est-à-dire le nombre d’unités) que vous ajoutez déterminera la quantité de substrat convertie en produit. Rappelons que 1 unité catalyse la conversion de 1 nmol de substrat par min (définition B).
Les unités / ml rapportées peuvent vous donner une idée approximative de la quantité d’enzyme à ajouter, mais comme la valeur d’activité n’a peut-être pas été déterminée dans un test identique au vôtre, il est habituel de préparer des dilutions en série de l’enzyme (par exemple, des dilutions logarithmiques au départ) et de tester un volume fixe de chaque dilution. En fonction du signal de dosage (qui sera lié à la quantité de substrat convertie), une deuxième expérience peut être nécessaire pour obtenir une dilution appropriée.
Quelle est exactement la « meilleure » dilution ? Pour répondre à cela, nous devons réfléchir à l’aspect le plus important de la conception du test – la gamme linéaire. Il est important que les travaux quantitatifs fonctionnent dans une plage dans laquelle un diagramme du signal de dosage (souvent l’absorbance) par rapport à la concentration enzymatique est linéaire. La plupart des essais sont linéaires si le degré de conversion du substrat est inférieur à 15%, en supposant qu’il n’y a pas d’autres facteurs limitatifs. En fixant le temps de dosage (par exemple 30 min) et la température (par exemple 25oC), le degré de conversion peut être contrôlé simplement en ajustant un paramètre, c’est-à-dire le nombre d’unités enzymatiques ajoutées.
Ceci est illustré graphiquement à la figure 1 avec des dilutions exprimées en va-et-vient (c’est-à-dire une dilution de 1/10 = 0,1 sur l’axe des abscisses). Votre propre tracé peut différer par sa forme et sa plage linéaire, mais à une concentration enzymatique très élevée, le signal de dosage n’augmentera pas proportionnellement à la quantité d’enzyme ajoutée.
Le dosage de la figure 1 est linéaire jusqu’à la densité optique (DO) 2,5 et un facteur de dilution de 0,02 (dilution de l’enzyme au 1/50) serait idéal pour le travail de dosage, car il donne un signal important (~ 1,5) et se situe au milieu de la plage linéaire. Les calculs basés sur les résultats de facteurs de dilution compris entre 0,04 et 0,12 (c’est-à-dire la région à pente réduite) sous-estimeront le niveau réel d’activité enzymatique car quelque chose limite clairement l’amplitude du signal d’essai.
De nombreux facteurs peuvent agir pour limiter la plage linéaire et la plage varie d’un essai à l’autre. Une raison courante de la non-linéarité est une consommation excessive de substrat, qui peut faire chuter la vitesse de réaction, mais les limitations des composants optiques du lecteur de plaques (ou de tout autre appareil de mesure utilisé) peuvent également être importantes. La plupart des lecteurs de plaques par example ne peuvent pas mesurer de manière fiable des valeurs d’absorbance supérieures à 3 et cette limitation s’appliquera quel que soit le pourcentage du substrat transformé en produit.
Fig.1. Absorbance Par rapport à la quantité d’enzyme
Bien qu’il ne soit pas autrement discuté dans ce guide, il faut également savoir que les enzymes peuvent se dénaturer avec le temps, surtout si elles sont très diluées, et que les produits de certaines réactions peuvent inhiber l’enzyme. En effet, il existe d’autres raisons possibles pour un comportement non linéaire, mais il est généralement relativement facile de trouver la plage linéaire par essais et erreurs en utilisant des dilutions en série de l’enzyme comme décrit ci-dessus.
Temps et température d’analyse
Ces paramètres peuvent également influencer la plage linéaire car ils affectent le taux de conversion du substrat. Par exemple, un dosage peut être linéaire après 15 min, mais à 60 minutes, une trop grande quantité de substrat peut avoir été consommée. Dans cette situation, vous devrez réduire la quantité d’enzyme afin d’exécuter votre test pendant 60 minutes. Les mêmes considérations s’appliquent à la température d’essai car elle peut également affecter la vitesse de réaction.
La plupart des gens adoptent un temps de dosage compris entre 15 min et 60 min. Des temps très courts (par exemple 2 min) sont à éviter car un léger retard dans l’arrêt de la réaction entraînera une erreur importante dans les calculs d’activité. Il est important de s’assurer que les réactifs stockés dans un réfrigérateur ou un congélateur se sont équilibrés à la bonne température avant utilisation, ce qui est particulièrement important si le temps d’analyse est relativement court.
Volume/sensibilité du dosage
D’un point de vue pratique, le volume du dosage est déterminé/limité par l’article consommable que vous utilisez pour vos dosages (par exemple, cuvettes, tubes ou microplaques). Le signal pour la plupart des tests enzymatiques est proportionnel au volume du test et les tentatives de miniaturisation du test (par exemple pour conserver les réactifs) conduiront généralement à des signaux plus faibles. Cependant, les tests d’absorbance sont souvent une exception, et un passage d’une cuvette de 3 ml à une micro-cuvette de 1 ml, par exemple, ne modifiera pas la lecture de l’absorbance si la largeur (longueur de trajet) de la cuvette est toujours de 1 cm (i.e. la lumière traverse toujours la même « longueur » de liquide). En effet, l’absorbance est proportionnelle à la longueur du trajet, et non au volume de l’échantillon.
Dans les tests d’absorbance sur microplaques, la longueur de trajet est égale à la profondeur du liquide, et il est possible de miniaturiser sans perte de signal en réduisant le diamètre des puits et en maintenant une profondeur de liquide constante. Par exemple, les plaques à 96 puits peuvent facilement accueillir 200ul d’échantillon, mais avec un volume d’analyse de 50ul, il serait préférable d’utiliser une plaque à 384 puits pour augmenter la longueur du trajet par rapport à celle observée avec 50ul d’échantillon dans une plaque à 96 puits.
Essais en continu (Mesure de l’apparence du produit dans le temps)
La plupart des essais sont effectués pendant une période déterminée (essais au point final) et la réaction est arrêtée par l’ajout d’un réactif d’arrêt (par exemple, acide). Cependant, dans les dosages continus, l’aspect du produit (plus rarement la consommation de substrat) est enregistré en continu (par ex. au moyen d’un enregistreur de cartes). Les mêmes règles de base s’appliquent; un graphique du signal par rapport au temps pour une quantité fixe d’enzyme doit être linéaire et le taux doit doubler si la quantité d’enzyme est doublée. Tant que le dosage est opéré dans la gamme linéaire, l’activité des « inconnues » diluées de manière appropriée peut être déterminée avec précision à partir des vitesses de réaction initiales mesurées avec un ensemble de normes.
Quelle Concentration De Substrat Dois-Je Utiliser?
La concentration du substrat influencera la vitesse de réaction, mais plusieurs facteurs doivent être pris en compte pour choisir la « bonne » concentration. D’un point de vue pratique, une considération clé est la quantité de produit qui doit être générée pour donner un signal d’analyse mesurable. La vitesse d’une réaction enzymatique étant susceptible de chuter lorsque plus de 15% environ du substrat a été hydrolysé, la concentration initiale de substrat doit généralement être au moins égale à 10 fois la concentration de produit connue pour donner un signal de dosage acceptable.
Une autre considération est le Km pour le substrat. Bien que l’ajout de plus de substrat signifie généralement que vous verrez des valeurs d’activité plus élevées, la relation n’est pas linéaire et le coût du substrat peut devoir être pris en compte. À ce stade, il est probablement utile d’introduire l’équation classique de Michaelis-Menten:
v=(Vmax S)/(Km + S)……………. Eqn. (1)
où v est la vitesse, Vmax est la vitesse maximale possible, S est la concentration en substrat et Km est égale à la concentration en substrat qui donne la moitié de l’activité maximale. La dérivation de cette équation et ses hypothèses sous-jacentes peuvent être trouvées dans n’importe quel manuel sur la cinétique des enzymes. Bien qu’il soit normal de mesurer plutôt que de calculer le taux de réactions enzymatiques, il est utile de comprendre les principes sous-jacents aux fins de la conception de l’essai.
L’équation de Michaelis-Menten est utile en ce qu’elle vous aide à sélectionner une concentration de substrat appropriée si le Km est connu.
Lorsque S = Km, v = (Vmax S)/2S, c’est-à-dire v/Vmax = S/2S = ½.
En d’autres termes, l’enzyme fonctionnera à 50% de sa vitesse maximale possible lorsque S = Km.
En substituant dans l’équation 1 les valeurs de S = 10 et Km = 1, vous verrez qu’en multipliant la concentration du substrat par 10, l’enzyme fonctionne maintenant à ~ 90% de sa vitesse maximale possible, au lieu de 50%. C’est clairement plus élevé, mais pas 10 fois plus élevé.
À des concentrations très élevées de substrat, le Km dans l’équation 1 devient numériquement insignifiant et la vitesse mesurée est alors égale à Vmax.
De nombreux essais sont effectués avec une concentration de substrat égale ou voisine de la valeur Km, mais si la valeur Km est très élevée, il peut ne pas être possible d’utiliser une concentration aussi élevée de substrat (p.ex. pour des raisons de coût ou de solubilité limitée).
Dans certaines situations, il peut même être conseillé d’utiliser une concentration de substrat relativement faible. Par exemple, dans la découverte de médicaments pharmaceutiques, l’utilisation de concentrations de substrat très élevées rendrait plus difficile l’identification d’inhibiteurs enzymatiques compétitifs (les inhibiteurs compétitifs se lient au même site que le substrat).
Il faut trouver un équilibre entre les différents facteurs pour que le test ait un signal mesurable, puisse fonctionner dans la gamme linéaire et puisse répondre à tous les autres objectifs du test (par exemple, coût, temps, etc.).
Courbes standard
Une courbe standard est toujours nécessaire si vous souhaitez calculer l’activité enzymatique. Ce n’est pas essentiel si vous n’êtes intéressé que par les valeurs d’activité relatives.
La courbe étalon est construite en mesurant le signal de dosage avec des solutions étalons du produit de réaction sur une plage de concentrations appropriée. Idéalement, vous devriez exécuter une courbe standard pour chaque expérience, mais si la courbe standard est très reproductible, il peut être acceptable de l’exécuter périodiquement.
Une courbe standard typique est illustrée à la figure 2 ci-dessous. Il s’agit d’une courbe standard pour un dosage de l’ATPase, dans laquelle l’ATP est hydrolysé en ADP et en Pi (phosphate inorganique).
Fig.2. Courbe standard pour Pi
Le phosphate est détecté au moyen d’un réactif de liaison au colorant qui change de couleur en présence de phosphate. Cependant, les spécificités de ce test ne sont pas importantes ici; quelle que soit la nature du produit ou la méthode de détection utilisée, une courbe standard montrant la dépendance du signal à la quantité de produit dans le test doit être construite. La « courbe » (idéalement une ligne droite) est utilisée pour déterminer la quantité de produit générée dans des échantillons à activité inconnue, c’est-à-dire à partir de la valeur d’absorbance, en lisant l’ordonnée à l’origine sur l’axe des abscisses. (La plupart des logiciels graphiques calculent automatiquement les valeurs de x à partir des valeurs mesurées de y). La quantité d’activité peut ensuite être calculée (voir plus loin).
Est-ce que je trace la Concentration ou la Quantité Absolue sur l’axe des Abscisses?
Il n’y a pas de réponse correcte unique ici, et la possibilité d’utiliser l’une ou l’autre approche peut souvent causer de la confusion lorsque les valeurs d’activité sont calculées. Par exemple, tracer nmol du produit sur l’axe des abscisses est très pratique si vous devez calculer les valeurs d’activité (rappelez-vous, activité = nmol par minute et par ml). Cependant, les réactifs de laboratoire sont généralement préparés à des concentrations connues, et il est souvent plus facile de tracer ces valeurs sur l’axe des abscisses. Cependant, lorsque vous calculez l’activité (ou l’activité spécifique) de votre enzyme, vous devez vous rappeler de convertir la concentration sur l’axe des abscisses en nombre de nmoles de produit formé, ce qui signifie que vous devez tenir compte du volume de dosage. La raison est facile à comprendre: les volumes 50ul et 100ul d’une solution standard seront à la même concentration, mais le plus grand volume contiendra deux fois la quantité de produit. En général, il est préférable de choisir une approche (c.-à-d. tracer la quantité absolue de produit ou la concentration) afin que la même méthode de calcul de l’activité soit toujours utilisée.
Les contrôles et la soustraction de données « vierges »
Des contrôles appropriés sont d’une importance vitale pour le travail quantitatif, tout comme l’utilisation correcte des données de contrôle dans les calculs.
Les contrôles vous indiquent (indirectement) quelle part du signal d’analyse est due à l’action de l’enzyme et quelle part survient pour d’autres raisons. Une source courante de « faux » signal est le substrat (qui peut souvent être contaminé par du produit). D’autres composants de dosage peuvent également donner lieu à un petit signal selon la nature des composants et le type de dosage. Le but des contrôles est de vous permettre de supprimer (par soustraction) tous les éléments du signal total qui ne sont pas liés à l’action de l’enzyme. Si le dosage est bien conçu et que les réactifs de dosage sont de bonne qualité, le traitement des contrôles est généralement assez simple.
Quelques lignes directrices générales sont données ci-dessous:
Si nous revenons au test colorimétrique pour la détection du phosphate inorganique, nous pouvons mettre en évidence certains problèmes potentiels qui sont facilement détectés avec des contrôles appropriés.
Le réactif de détection de phosphate donne une lecture faible d’environ 0,08 dans une plaque à 96 puits à la longueur d’onde utilisée pour la mesure (environ 650 nm).
Nous pourrions mettre en place les tests / contrôles suivants (lectures entre parenthèses dans une situation de test hypothétique):
- Tous les composants du test moins l’enzyme (0,5)
- Enzyme seule (0,1)
- Enzyme plus tous les autres composants (1,8)
Il est clair que le signal de test de 1,8 n’est pas dû uniquement à l’action de l’enzyme sur le substrat.
Pour tout dosage enzymatique, un contrôle clé (A) consiste à laisser de côté l’enzyme (et à la remplacer par du tampon). Cela vous donnera le signal de fond pour tous les autres composants du test en tant que groupe, y compris le substrat qui peut contenir une petite quantité de produit. Ce contrôle ne vous indique pas le signal de fond pour l’enzyme, mais il est clair que vous ne pouvez pas ajouter l’enzyme au substrat en tant que contrôle! Dans la plupart des essais, l’enzyme ne donne aucun signal car elle est diluée de manière significative avant utilisation dans le test. Cela peut facilement être vérifié, comme dans B ci-dessus.
Les données de l’échantillon A (ci-dessus) suggèrent que le mélange est contaminé par du phosphate inorganique. Les composants individuels peuvent ensuite être vérifiés pour identifier la source du problème. Cette situation est assez courante pour les dosages d’ATPases et d’autres enzymes générateurs de phosphate, car les substrats sont souvent instables et sont partiellement hydrolysés pour donner du phosphate inorganique.
Il peut être difficile de corriger des données brutes si plusieurs composants donnent de faux signaux; l’élimination du problème à la source est généralement bien meilleure que tout traitement mathématique. La valeur » corrigée » de l’échantillon C ci-dessus peut sembler être de 1,2 (c.-à-d. 1.8 – 0.5 – 0.1 ) mais à proprement parler, c’est faux. N’oubliez pas que la plaque de dosage et le réactif de détection donnent un signal de fond d’environ 0,08, de sorte que la source de la majeure partie du signal pour le contrôle A est le plastique de la plaque et / ou le réactif de détection. Le même petit signal doit également être caché dans la valeur du contrôle enzymatique. Ainsi, dans la correction appliquée ci-dessus, nous avons soustrait deux fois ce blanc caché.
Vous devrez toujours soustraire les contrôles des données de test, et il est préférable de combiner toutes les substances (sauf l’enzyme) et de soustraire une seule valeur. Si cette approche est adoptée, la courbe étalon est traitée de la même manière et une valeur témoin est soustraite (c’est-à-dire la valeur obtenue en l’absence de produit, c’est-à-dire analogue à l’ébauche plaque/réactif discutée ci-dessus). Ainsi, ni les données de dosage soustraites ni la courbe étalon soustraite ne contiennent le signal de fond potentiellement trompeur provoqué par la plaque / réactif de dosage.
Enfin, comme nous l’avons vu, les faux signaux sont facilement détectés avec des contrôles appropriés, mais la meilleure stratégie pour obtenir des données de bonne qualité est d’utiliser des réactifs avec des arrière-plans bas afin que les valeurs des contrôles soient faibles. Il est également utile de générer un signal de dosage (dû à l’enzyme) qui est beaucoup plus élevé que n’importe quel signal de fond. Idéalement, le rapport signal sur fond devrait être d’au moins 5 et de préférence de 10 ou plus pour un travail quantitatif précis.
Calcul des valeurs d’activité
Ceci est assez facile à comprendre si nous calculons à partir des données d’analyse brutes par étapes. Par exemple, disons que nous avons généré 10nmol de produit dans notre réaction enzymatique (c’est-à-dire déterminée à partir de la courbe standard du signal par rapport à la quantité absolue de produit). Puisque l’activité est exprimée en nmol par minute et par ml, nous devons considérer le temps et le volume et, peut-être moins évidemment, la quantité et la dilution de l’enzyme afin de calculer l’activité.
Si le dosage dure 10 min, le nombre de nmol par min dans l’exemple ci-dessus est de 1. (step1)
Si le volume de dosage est de 200ul, nous devons multiplier par 5 (c’est-à-dire 1000/200) pour obtenir nmol par minute et par ml. (étape 2)
Cette valeur se rapporte à l’activité de l’enzyme dans le dosage, et non dans l’échantillon d’enzyme utilisé pour mettre en place le dosage. D’autres facteurs de correction sont nécessaires pour déterminer l’activité enzymatique dans l’échantillon original d’enzyme.
L’enzyme peut avoir été diluée avant utilisation, et elle doit être encore diluée par les autres composants présents dans le dosage. Si le dosage (200ul au total) comprend 20ul d’enzyme, et que l’enzyme est pré-diluée 1/100 avant l’ajout de l’échantillon de 20ul, vous pouvez probablement voir qu’il faut d’abord multiplier par 10 (étape 3) puis par 100 (étape 4) pour obtenir l’activité de l’enzyme dans la solution d’enzyme d’origine.
Jusqu’à présent, c’est relativement simple. Cependant, nous avons mentionné précédemment que la concentration est souvent tracée sur l’axe des abscisses de la courbe standard. Ainsi, les valeurs peuvent être exprimées en mM (pas en mmol) et vous ne pouvez pas déterminer le nombre de mmol simplement en inspectant la courbe standard.
Puisque mM signifie mmoles par litre, nous avons un écart entre le volume implicite de 1L et le volume réel du dosage. Ainsi, si nous avons un produit de 10 mm et que le volume d’analyse est de 200ul, nous devons diviser par 5000 pour obtenir le nombre de mmoles de produit.
Vous remarquerez peut-être ici que la division par 5000 compense ici certaines des opérations de multiplication qui étaient nécessaires ci-dessus. En effet, il est tout à fait normal que les facteurs de correction s’annulent. Par exemple, dans un essai de 10 minutes utilisant une enzyme diluée au 1/10, vous diviserez par 10 pour obtenir nmol par minute et multiplierez par 10 plus tard pour corriger le facteur de dilution.
Il s’ensuit que si vous utilisez toujours des conditions d’analyse standard (i.e. votre norme), vous pourrez multiplier la valeur « x » de la courbe standard par un seul facteur de correction global, qui englobe tous les autres facteurs de correction individuels, pour calculer vos valeurs d’activité. Ce n’est que la première fois que vous devez identifier les facteurs de correction individuels.
Inhibition enzymatique /Dépistage des médicaments
Il s’agit d’un domaine de l’enzymologie où il reste nécessaire d’opérer dans la gamme linéaire, mais où les calculs des valeurs d’activité ne sont généralement pas pertinents; au contraire, la vitesse relative de réaction (ou la quantité relative de produit formé) en présence et en l’absence d’une substance d’essai est essentielle, ce qui ne nécessite guère plus que de simples calculs utilisant les données d’essai soustraites à blanc. Après soustraction des flans, la quantité de produit formé est exprimée en pourcentage de la quantité obtenue en l’absence de la substance d’essai (soit 100%). Ces essais peuvent parfois être effectués avec des rapports signal/ fond assez faibles, car la question posée est-elle que la substance d’essai inhibe-t-elle la réaction?
– ne nécessite qu’une réponse oui/non.
Résumé
Ce guide a, espérons-le, fourni des explications claires sur les « unités enzymatiques », l‘ »activité enzymatique » et l’ »activité enzymatique spécifique », ainsi que sur les définitions des unités et l’importance de la « gamme linéaire ». Les spécificités de ce qu’il faut tracer sur l’axe des abscisses des courbes standard sont une question de préférence de l’utilisateur, mais un certain soin est nécessaire lorsque les activités sont calculées. Les contrôles de dosage sont importants, mais l’utilisation de réactifs de haute qualité est préférable à la suppression des arrière-plans à l’aide d’approches mathématiques. Un rapport signal / fond élevé est souhaitable pour les travaux quantitatifs et un certain nombre de paramètres peuvent être modifiés pour augmenter le signal de dosage; il n’est pas toujours nécessaire d’ajouter simplement plus d’enzyme. Les valeurs d’activité enzymatique peuvent être calculées facilement si une approche par étapes est utilisée pour identifier les variables clés du test.
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