Identification de Bordetella pertussis chez un Patient Infecté par le Virus de l’Immunodéficience Humaine Gravement Malade par Analyse Génotypique Directe de Matériel Coloré au Gram et Discrimination de B. holmesii en utilisant un Site unique enzymatique de restriction du gène recA

L’identification des bactéries à partir d’échantillons cliniques se fait en grande partie par caractérisation phénotypique après culture in vitro et microscopie. Cependant, il n’est pas rare que des préparations directement colorées au gramme révèlent de nombreux organismes, mais les cultures ne démontrent pas d’agent pathogène. Cela a été illustré dans un cas clinique récent, dans lequel un homme de 48 ans atteint du SIDA a été admis avec une coccidioïdomycose pulmonaire. Malgré un traitement antifongique, son état ne s’est pas amélioré. Des échantillons d’expectorations ont révélé de nombreux bacilles à gram négatif en microscopie directe, mais aucun agent pathogène en culture. De plus, plusieurs hémocultures ont développé des bâtonnets gram négatifs fastidieux, qui ne pouvaient pas être spécifiés par des méthodes conventionnelles.

Nous avons décidé de tenter l’identification des deux isolats par des méthodes génotypiques utilisant des amorces oligonucléotidiques universelles visant le gène de la petite sous-unité ARNr (ARNr 16S). Parmi les échantillons respiratoires, cependant, seules des lames colorées au gramme étaient disponibles. Nous avons donc développé une nouvelle méthode, dans laquelle l’ADN bactérien est récupéré directement à partir de la lame colorée en Gram. Les diapositives ont été colorées au gramme selon la méthodologie traditionnelle (12). Une lame de verre transparente a été enduite d’échantillons et traitée avec du méthanol absolu (Mallinckrodt, Hazelwood, Mo.), suivie d’une fixation thermique à 65°C et d’un traitement avec une solution cristalline violette (Remel, Lenexa, Kans.). La lame a ensuite été traitée avec de l’iode de Gram (Remel), décolorée avec une solution alcool-acétone (3:1) et contre-colorée avec de la safranine (Remel). L’huile d’immersion a d’abord été retirée de la lame avec du xylène à 100% (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) puis rincée dans de l’éthanol à 100%. Ensuite, le matériau a été mis au rebut avec une lame de rasoir droite, en suspension dans 50 µl de solution d’hydratation Puregene-ADN (Gentra, Minneapolis, Minn.), vortexé et bouilli pendant 10 min. Pour l’analyse de l’isolat sanguin, du matériel provenant à la fois de la bouteille de BACTEC et de colonies cultivées sur milieu solide a été utilisé. La PCR subséquente a été réalisée dans un volume de 50 µl contenant 5 µl de la matrice, 1,5 mm MgCl2, 100 µM chaque désoxynucléoside triphosphate (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind.), 1 U d’ADN polymérase Taq (Roche Diagnostics Corporation), et 0,15 µM (chacun) d’amorces universelles d’ARNr 16S 11E (5′-GAGGAAGGTGGGGATGACG-3′) et 13B (5′-TCCGGGCCTTGCATAAGTG-3′) comme décrit précédemment (15). Après une étape de dénaturation de 5 min à 94°C, des étapes de PCR de 94°C pendant 60 s, 50°C pendant 60 s et 72°C pendant 90 s ont été répétées 30 fois dans un système de PCR Perkin-Elmer GeneAmp 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Californie.). Les produits ont été obtenus à partir des expectorations et du sang (Fig. 1). Ceux-ci ont été purifiés avec le kit de purification par PCR QIAquick (Qiagen Inc., Valence, Californie.), et le séquençage de l’ADN a été effectué sur un séquenceur Applied Biosystems ABI3100 (HHMI Biopolymer / W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, École de médecine de l’Université de Yale). Une comparaison ultérieure avec la base de données publique (GenBank) par BLAST(1) a identifié l’isolat sanguin comme Helicobacter cinaedi ou Helicobacter rappini. Les deux organismes ont été associés à des bactériémies chez des patients immunodéprimés (9, 10, 13, 16, 17). Le produit de PCR de l’isolat respiratoire correspondait aux gènes de l’ARNr 16S de Bordetella pertussis et de Bordetella holmesii, qui sont homologues à 99,5 % et identiques dans la région amplifiée (18).

Afin de specialiser l’isolat respiratoire de Bordetella et de valider le résultat de l’analyse génotypique, un test discriminatoire a été développé dans lequel une partie du gène recA (6, 7), qui contient un site enzymatique de restriction unique, a été ciblée. Amplification de B. pertussis (ATCC 9340; American Type Culture Collection, Manassas, Va.) et l’ADN de B. holmesii (ATCC 51541) ainsi que celui de la coloration au gramme des expectorations de notre patient ont été réalisés comme décrit ci-dessus, sauf que 3 mm MgCl2 et des amorces spécifiques nouvellement conçues (forward, 5′-CAATACGCCTCCAAGCTGGG-3′; et inversement, 5′-TGATGTCGAACTCGGCCTGC-3′) ont été utilisés, et les étapes de PCR (94 °C pendant 30 s, 59 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 60 s) ont été répétées 45 fois suivies d’une étape d’allongement final à 72 °C. Les produits ont été digérés avec du NciI selon les recommandations du fabricant (New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.). Les deux organismes peuvent être facilement distingués parce que B. holmesii possède deux sites NciI, alors que B. pertussis et tous les autres Bordetella spp. un seul site NciI dans la région amplifiée. L’isolat d’expectorations a ensuite été identifié comme étant B. pertussis (Fig. 2) et a été signalé comme un pathogène pulmonaire opportuniste chez des patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (4, 5).

Nous avons ensuite cherché à déterminer si l’identification génotypique des organismes directement à partir de préparations cliniques de coloration de Gram avec des amorces universelles était une méthode réalisable et reproductible. Le type de fixation (chaleur, 100% méthanol et 100% éthanol) et la présence de restes de colorant après coloration de Gram comme décrit ci-dessus n’interfèrent pas avec la PCR. Une limite de détection de 1 500 UFC/µl d’expectorations (6 à 30 organismes par champ d’immersion dans l’huile) a été trouvée, ce qui est similaire à d’autres rapports (14). Pour cette découverte, trois échantillons d’expectorations cliniques aléatoires sans bactéries sur la tache de Gram ou en culture ont été regroupés, dopés avec des quantités définies d’Escherichia coli (ATCC 25922), fixés et colorés au Gram, et raclés de la lame comme décrit ci-dessus. Plusieurs échantillons cliniques choisis au hasard ont été testés, et lorsqu’un organisme prédominant était visible au microscope, son identification correspondait à l’agent pathogène en culture (tableau 1).

Notre méthode présente plusieurs avantages par rapport aux essais décrits précédemment. Contrairement aux rapports précédents, dans lesquels l’ADN est d’abord extrait des expectorations et des amorces spécifiques à l’espèce sont utilisées (2, 11, 14, 19, 20), notre analyse utilise de l’ADN récupéré directement à partir de lames colorées au gramme sans étapes d’extraction et utilise des amorces universelles, permettant ainsi l’identification d’un large éventail de bactéries avec un protocole simple. Comme montré, cela peut être réalisé même en présence d’une flore résidente de fond normale car le nombre de cycles de PCR est limité, permettant ainsi une amplification compétitive de l’ADN bactérien. Étant donné que la qualité de l’échantillon soumis et les proportions relatives de microbes morphologiquement différents peuvent être facilement déterminées sur des taches de gramme, des frottis appropriés peuvent être sélectionnés avant l’amplification de l’ADN. De plus, l’aspect de tache de gramme de l’organisme prédominant sert de contrôle de qualité interne après identification génotypique. Comme pour l’identification phénotypique, les résultats de notre test doivent être corrélés avec le tableau clinique avant de prendre des décisions de traitement, car aucune des deux méthodes ne peut distinguer de manière fiable la colonisation et l’infection.

Parmi les rares rapports dans la littérature anglophone décrivant la récupération d’acide nucléique à partir d’échantillons cliniques sur lames de verre (3, 8), aucun à ce jour n’a décrit l’amplification de l’ADN après la récupération de bactéries à partir de lames colorées au gramme. Notre méthode est rapide et fiable et peut être utilisée comme outil dans les cas où des organismes sont vus en abondance sur des lames cliniques colorées au gramme, mais ne peuvent pas être récupérés en culture. La technique peut être particulièrement utile lorsqu’un diagnostic est recherché rétrospectivement ou après que les échantillons originaux ont été jetés.

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