Jackson a commencé à jouer un petit rôle dans le film Crooked Hearts en 1991. L’année suivante, il joue le rôle de Charlie dans une version musicale de Willie Wonka et la Chocolaterie. À ce stade, avec l’aide de la directrice de casting de la pièce, Laura Kennedy, il rejoint l’agence William Morris. Peu de temps après, il décroche le rôle de Charlie (#96) dans la série des Mighty Ducks, incarnant un jeune joueur de hockey en herbe.
Joshua Jackson a ensuite joué le rôle de Pacey Witter dans Dawson’s Creek, créé par Kevin Williamson et diffusé sur le réseau WB de 1998 à 2003, et a également joué James Van Der Beek, Michelle Williams et Katie Holmes. Alors que la série était en pause, il est apparu dans plusieurs films dont Cruel Intentions (une adaptation yuppie new-yorkaise des Liaisons dangereuses qui mettait également en vedette Sarah Michelle Gellar et Ryan Phillippe), Les Crânes, La Sécurité des objets, Le Projet Laramie et un court caméo dans le remake d’Ocean’s Eleven dans lequel il apparaît comme lui-même dans une scène de poker avec Brad Pitt, George Clooney et Holly Marie Combs, entre autres. En 2000, il a également joué dans la saison 12 des Simpson, exprimant le personnage de Jesse Grass, un « environnementaliste hunky » et amoureux de Lisa Simpson dans l’épisode « Lisa the Tree Hugger ». Il a également joué le rôle de « Beau » dans le film Gossip en 2000 avec les acteurs James Marsden, Kate Hudson et Norman Reedus.
Peu après la fin de Dawson’s Creek en 2003, Jackson a joué le rôle principal dans des films aux côtés de Dennis Hopper (Americano), Harvey Keitel (Shadows in the Sun) et Donald Sutherland (Aurora Borealis). En 2005, Jackson s’installe au Royaume-Uni et fait ses débuts sur scène dans le West End londonien avec Patrick Stewart dans la pièce à deux hommes de David Mamet, A Life in the Theatre. La pièce est un succès critique et populaire, et se déroule de février à avril de la même année. Jackson a déclaré qu’il envisagerait de retourner sur scène pour s’essayer à Broadway. Son prochain rôle au cinéma était dans Bobby, réalisé par Emilio Estevez, la co-star de Jackson des Mighty Ducks. Il a joué un rôle principal dans Shutter, un remake américain d’un film d’horreur thaïlandais du même nom. Il a joué et a agi en tant que producteur exécutif dans le film indépendant canadien One Week, qui a pris l’affiche le 6 mars 2009.
De 2008 à 2013, Jackson a joué le rôle principal de Peter Bishop dans la série de science-fiction Fringe, créée par JJ Abrams, Roberto Orci et Alex Kurtzman. La série est apparue sur le réseau de télévision Fox et était la deuxième nouvelle émission la mieux notée de la saison 2008-2009 après The Mentalist de CBS. BuddyTV l’a classé # 9 sur sa liste des « 100 Hommes les plus sexy de 2010 », #19 en 2011 et #14 en 2012.
Jackson a été nominé pour le Prix Génie de la Meilleure Performance d’un Acteur dans un rôle principal pour le film One Week. Il a remporté le prix le 12 avril 2010. Il a tenu et animé le Pacey-Con satirique en 2010, juste en face du Comic-Con de San Diego, arborant un maillot de bowling et distribuant des fan-fictions, écrites par des fans de Dawson’s Creek, à ceux qui attendaient dans la ligne d’entrée du Comic-Con. Des images de l’événement ont été enregistrées pour une vidéo, intitulée « Pacey-Con », qu’il filmait pour le site Web d’humour de célébrités Funny or Die de Will Ferrell. En 2013, Jackson est apparu dans le film Inéluctable de la SFI avec Marisa Tomei et Alexander Siddig. Jackson a écrit la première histoire de la trilogie de bandes dessinées Beyond the Fringe, intitulée « Peter and the Machine ». Jackson a joué dans l’émission de télévision à succès Showtime, The Affair, où il a joué Cole Lockhart, le mari protagoniste de l’infidèle Alison Lockhart.
En mars 2018, Jackson fait ses débuts au théâtre à Broadway, Children of a Lesser God, où il joue James Leeds, un professeur non conventionnel à l’école pour sourds qui entretient une relation professionnelle et amoureuse conflictuelle avec une ancienne élève sourde, Sarah Norman (Lauren Ridloff). La pièce a duré jusqu’en mai 2018.
En 2019, Jackson a joué le rôle de l’avocat de la défense Mickey Joseph dans la mini-série dramatique Netflix When They See Us.
En 2020, Jackson a joué avec Reese Witherspoon et Kerry Washington dans la mini-série de Hulu Little Fires Everywhere basée sur le roman de Celeste Ng.
Jackson a été castée dans le rôle-titre dans Dr. Death, basé sur le podcast du même nom.