Chromatographie en phase liquide à haute performance La spectrométrie de masse est une technique instrumentale extrêmement polyvalente dont les racines résident dans l’application de la chromatographie en phase liquide plus traditionnelle aux théories et à l’instrumentation qui ont été développées à l’origine pour la chromatographie en phase gazeuse (GC). Comme son nom l’indique, l’instrumentation comprend un chromatographe liquide haute performance (HPLC) relié, via une interface adaptée, à un spectromètre de masse (MS). Le principal avantage de la CLHP / MS par rapport à la GC / MS est qu’elle est capable d’analyser une gamme beaucoup plus large de composants. Les composés thermiquement labiles, présentant une polarité élevée ou ayant une masse moléculaire élevée peuvent tous être analysés en HPLC/ MS, même les protéines peuvent être analysées de manière routinière. Les solutions dérivées d’échantillons d’intérêt sont injectées sur une colonne HPLC qui comprend un tube étroit en acier inoxydable (généralement de 150 mm de longueur et 2 mm de diamètre interne, ou plus petit) emballé avec de fines particules de silice chimiquement modifiées. Les composés sont séparés sur la base de leur interaction relative avec le revêtement chimique de ces particules (phase stationnaire) et le solvant éluant dans la colonne (phase mobile). Les composants éluant de la colonne chromatographique sont ensuite introduits dans le spectromètre de masse via une interface spécialisée. Les deux interfaces les plus couramment utilisées pour la CLHP/MS sont l’ionisation par électrospray et les interfaces d’ionisation chimique à pression atmosphérique.
Ionisation par électrospray
Dans l’ionisation par électrospray, l’analyte est introduit dans la source à des débits typiquement de l’ordre de 1µl min-1. Le flux de solution d’analyte passe à travers l’aiguille d’électrospray qui présente une différence de potentiel élevée (par rapport à la contre-électrode) appliquée (typiquement dans la plage de 2,5 à 4 kV). Cela force la pulvérisation de gouttelettes chargées de l’aiguille avec une charge de surface de même polarité à la charge sur l’aiguille. Les gouttelettes sont repoussées de l’aiguille vers le cône de prélèvement de la source sur la contre-électrode (représentée en bleu). Lorsque les gouttelettes traversent l’espace entre la pointe de l’aiguille et le cône, l’évaporation du solvant se produit. Ceci est encerclé sur la Fig.1 et agrandie sur la Fig.2. Lorsque l’évaporation du solvant se produit, la gouttelette se rétrécit jusqu’à ce que la tension superficielle ne puisse plus supporter la charge (limite de Rayleigh), point auquel une « explosion coulombique » se produit et la gouttelette est déchirée. Cela produit des gouttelettes plus petites qui peuvent répéter le processus ainsi que des molécules d’analyte chargées nues. Ces molécules d’analyte chargées (ce ne sont pas strictement des ions) peuvent être chargées seules ou se multiplier. C’est une méthode d’ionisation très douce car très peu d’énergie résiduelle est retenue par l’analyte lors de l’ionisation. C’est la génération de molécules chargées à plusieurs reprises qui permet d’analyser des composants de poids moléculaire élevé tels que des protéines, car la plage de masse du spectromètre de masse est considérablement augmentée puisqu’il mesure en fait le rapport masse / charge plutôt que la masse en soi. L’inconvénient majeur de la technique est que très peu (généralement pas) de fragmentation est produite bien que cela puisse être surmonté par l’utilisation de techniques de spectrométrie de masse en tandem telles que MS / MS ou MSn.
Figure 1 Un schéma d’une interface ESI
Figure 2 Un schéma du mécanisme de formation d’ions
Ionisation chimique à pression atmosphérique
Ionisation chimique à pression atmosphérique l’ionisation (APCI) est une méthode d’ionisation analogue à l’ionisation chimique (CI). La différence significative est que l’APCI se produit à pression atmosphérique et a ses principales applications dans les domaines de l’ionisation de composés de faible masse (l’APCI ne convient pas à l’analyse de composés thermiquement labiles). La configuration générale de la source (voir fig. 3) partage une forte ressemblance avec ESI. Là où l’APCI diffère de l’ESI, c’est dans la manière dont l’ionisation se produit. En ESI, l’ionisation est achetée environ par la différence de potentiel entre l’aiguille de pulvérisation et le cône avec une désolvation rapide mais douce. Dans APCI, la solution d’analyte est introduite dans un nébuliseur pneumatique et désolvée dans un tube de quartz chauffé avant d’interagir avec la décharge corona créant des ions. La décharge corona remplace le filament électronique en CI – la pression atmosphérique « brûlerait » rapidement tous les filaments – et produit N2°+ et N4°+ primaires par ionisation électronique. Ces ions primaires entrent en collision avec les molécules de solvant vaporisées pour former des ions gazeux réactifs secondaires, par exemple H3O+ et (H2O) nH+ (voir Fig. 4). Ces ions gazeux réactifs subissent ensuite des collisions répétées avec l’analyte entraînant la formation d’ions analytes. La fréquence élevée des collisions se traduit par une efficacité d’ionisation et une thermalisation élevées des ions analytes. Il en résulte des spectres d’espèces moléculaires prédominantes et d’ions d’adduits avec très peu de fragmentation. Une fois que les ions sont formés, ils entrent dans l’étape de pompage et de focalisation de la même manière que ESI.
Figure 3 Un schéma des composants d’une source APCI
Figure 4 Une vue plus détaillée du mécanisme de l’APCI
Diagrammes et texte (partiels) par le Dr Paul Gates, École de chimie, Université de Bristol