L’avènement de la biologie aérobie a été annoncé il y a environ deux milliards d’années, lorsque les cyanobactéries primitives ont développé la capacité de photooxidifier l’eau. L’oxygène a été libéré sous forme de déchets, et les niveaux atmosphériques d’O2 ont augmenté rapidement. Ce changement rapide vers une atmosphère oxygénée a introduit un polluant dévastateur, mais les organismes ont finalement évolué en capitalisant sur la forte force motrice de la réduction de l’O2. Des sites actifs enzymatiques capables de lier et d’activer l’oxygène ont évolué, et de nouvelles classes de biochimie utilisant l’O2 comme puits thermodynamique pour entraîner des réactions autrement défavorables sont devenues possibles. L’efficacité du métabolisme alimentaire a radicalement changé. La quantité d’ATP qui pourrait être produite en métabolisant le glucose par voie aérobie, par exemple, a été multipliée par près de 20. Les eucaryotes sont apparus peu de temps après l’atmosphère oxygénée et ont finalement été suivis par la gamme diversifiée d’organismes multicellulaires qui existent aujourd’hui. Dans notre biochimie aérobie, l’O2 est utilisé dans une pléthore de réactions synthétiques qui sont fondamentales pour presque tous les aspects de la croissance, du développement et de la reproduction des cellules.
Malgré sa polyvalence biochimique, >95% de l’oxygène que nous consommons est utilisé dans la respiration. Les électrons de haute énergie dérivés de la nourriture traversent la chaîne de transport des électrons mitochondriaux dans une série de réactions redox exergoniques. Ces transferts d’électrons en descente énergétique sont utilisés pour développer le gradient de protons chimisosmotiques qui produit finalement de l’ATP. L’oxygène est l’accepteur d’électrons final dans cette cascade respiratoire, et sa réduction en eau est utilisée comme véhicule permettant de dégager la chaîne mitochondriale des électrons usés de faible énergie. L’enzyme qui catalyse ce processus, la cytochrome oxydase, s’étend sur la membrane mitochondriale. Il lie, active et réduit jusqu’à 250 molécules d’O2 par seconde et couple l’énergie libérée dans ce processus à la translocation des protons qui contribuent au gradient chimiosmotique. Le mécanisme par lequel la cytochrome oxydase catalyse cette chimie remarquable a été étudié intensément. Les résultats rapportés dans ce numéro par Fabian, Wong, Gennis et Palmer fournissent un nouvel aperçu de ce processus et soutiennent l’idée croissante qu’il existe des concepts unificateurs pour la façon dont les enzymes utilisant l’oxygène activent O2 pour le clivage et la réduction des liaisons O⩵O (1).
La réduction de l’O2 dans la cytochrome oxydase se produit sous des contraintes sévères. Le processus se déroule avec peu de surpotentiel, la libération d’intermédiaires d’oxygène toxiques partiellement réduits à partir du site actif est minimisée et l’énergie libre disponible dans la réduction d’O2 est couplée à une efficacité élevée à la translocation des protons (2, 3). L’enzyme opère sous ces contraintes en utilisant un hème Fe, appelé hème a3, et un ion cuivre, appelé CuB, dans un centre binucléaire dans lequel O2 se lie et se réduit (voir Fig. Figue.1).1). L’entrée d’électrons dans ce site se fait à partir du cytochrome c par l’intermédiaire d’un deuxième fer hémique, l’hème a, et d’un deuxième centre de cuivre, le CuA. Récemment, le groupe de Yoshikawa (4) et le groupe de Michel (5) ont fourni indépendamment et simultanément des structures cristallines de l’enzyme qui ont donné un aperçu approfondi de nombreux aspects du cycle catalytique, en particulier de la manière dont les protons et l’oxygène sont susceptibles de se déplacer dans la protéine. Le mécanisme de réduction de l’O2 par l’oxydase a été poursuivi par un certain nombre de groupes avec une variété de techniques spectroscopiques (pour les revues, voir refs. 6 et 7). À partir de ces travaux, une séquence de réaction simplifiée impliquant des intermédiaires transitoires, mais détectables, au centre binucléaire peut être écrite comme suit (voir également Fig. Figue.2): 2):
Les espèces P et F, en particulier, ont attiré l’attention, car elles ont été impliquées dans le mécanisme de pompage qui entraîne la translocation des protons (8) . Des travaux récents de Michel (9) et de Wikström et de ses collègues (10) ont mis en évidence à la fois les progrès et les incertitudes dans notre compréhension du mécanisme qui couple les transferts d’électrons exergoniques à l’oxygène avec le mouvement endergonique du proton à travers la membrane.
Le centre binucléaire de la cytochrome oxydase. L’hème a3 et l’ourson sont représentés avec le ligand proximal du fer hémique, H376, et le ligand Ourson, H240, qui est réticulé à Y244 (24, 25). La liaison et la réduction de l’O2 se produisent dans la région située entre le fer a3 et le CuB.
Un schéma simplifié pour la réaction entre la cytochrome oxydase et l’O2. Le site binucléaire, qui contient l’hème a3, CuB, et la structure réticulée H240-Y244 (H-Y), est représenté. La réduction et la protonation de la forme oxydée du centre produisent le site réduit. Cela lie O2 pour former initialement l’espèce oxy, qui réagit davantage pour produire des intermédiaires P et F, avant de régénérer la forme oxydée de l’enzyme. La réduction de P et F est limitée par des réactions de transfert de protons, comme indiqué. Les étapes entre P et la forme réduite du site ont été impliquées dans les processus de pompage de protons, qui sont indiqués par des flèches rouges. La stœchiométrie de ces étapes est une question d’investigation actuelle, bien que jusqu’à quatre protons puissent être pompés au cours du cycle complet.
Un problème continu pour démêler la chimie de l’oxygène au centre binucléaire de la cytochrome oxydase et sa liaison à la pompe à protons consiste à établir les structures moléculaires des intermédiaires dans le schéma ci-dessus. Il y a consensus sur le fait que l’intermédiaire F implique un intermédiaire ferryl-oxo au niveau de l’hème a3, a34 +⩵O (3, 6, 11, 12), mais la structure de P a fait l’objet d’une controverse considérable. Les affectations initiales de cette espèce posaient qu’elle contenait une liaison intacte, l’espèce a33+—O2⩵, d’où sa désignation comme P pour « peroxy » (par exemple, refs. 3, 8 et 13). Weng et Baker, cependant, ont interprété leurs données optiques pour indiquer que le clivage de la liaison O-O s’était déjà produit à P et que cette espèce avait également une structure a34+⩵O au centre binucléaire (14). Cette conclusion a ensuite été étayée par plusieurs études spectroscopiques (15-17). Kitagawa, Proshlyakov et leurs collègues ont réussi à utiliser la spectroscopie Raman pour détecter le mouvement d’étirement a34 +⩵O (18, 19) sous une forme de P générée par l’ajout de peroxyde à l’enzyme oxydée. Des travaux ultérieurs ont montré que la même vibration pouvait être observée lorsque de l’oxygène est ajouté à une forme réduite à deux électrons de l’enzyme, confirmant que la chimie de l’oxygène et la chimie du peroxyde dans l’oxydase passent par des intermédiaires communs (20). De plus, l’évolution temporelle de l’apparition de P dans ce travail a montré que cette espèce est cinétiquement compétente (voir également refs. 21 et 22). Ainsi, à partir des travaux spectroscopiques, et des travaux informatiques récents également (23), la vision émergente est que P est bien une espèce clivée par liaison O-O.
Les travaux rapportés par Fabian et al. (1) fournit une preuve nouvelle, indépendante et convaincante que la liaison O-O est clivée dans la cytochrome oxydase au niveau P. Dans leurs expériences, ils ont estimé qu’aucun atome d’oxygène dans une structure peroxy intacte n’est susceptible d’échanger avec de l’eau solvant. Si P se présente comme l’espèce a34 +⩵O, cependant, on s’attend à ce que le deuxième atome d’oxygène soit probablement au niveau de l’hydroxyde ou de l’eau et que cet oxygène puisse bien échanger avec l’eau dans le tampon aqueux. En utilisant le 18O2 comme substrat dans un tampon aqueux contenant du H216O, ils ont piégé l’intermédiaire P et ont dosé l’apparition de H218O. Leurs résultats spectrométriques de masse montrent clairement qu’un seul atome d’oxygène du substrat 18O2 est échangeable avec de l’eau solvant, en excellent accord avec leur analyse ci-dessus et l’affectation de P comme espèce ferryl-oxo clivée par liaison.
La réalisation que P a une structure a34 +⩵O a un certain nombre d’implications importantes. La transformation de l’O2 lié dans l’espèce oxy en hydroxyde (ou eau) et en un ferryl-oxo dans P nécessite un total de quatre électrons. Seulement trois, cependant, sont facilement disponibles dans le centre binucléaire – deux de l’hème a3 lorsqu’il passe de l’état de valence +2 à +4 et un de CuB lorsqu’il est oxydé de cuivreux à cuivrique. La source du quatrième électron n’est pas claire. L’oxydation du macrocycle de l’hème, comme cela se produit dans les composés I dans certaines peroxydases, peut être éliminée sur la base des données Raman et optiques (6, 7), et le Cu3+ n’a pas été détecté en milieu biologique. Le candidat le plus probable est donc une chaîne latérale protéique redox-active, comme cela se produit dans la peroxydase du cytochrome c, dans laquelle le tryptophane est actif redox, ou dans la prostaglandine synthase, qui contient un résidu tyrosine oxydable (24). Yoshikawa et ses collègues (25) ont fourni des preuves cristallographiques frappantes qui soutiennent fortement l’apparition d’une chaîne latérale redox-active. Ils ont montré que Y244 au centre binucléaire est réticulé à l’un des ligands CuB, H240, et que le groupe tête de phénol est orienté de sorte que le groupe -OH pointe directement dans la cavité de liaison à l’O2 (Fig. (Figue.1).1). Michel a rapporté des données cristallographiques similaires (26), et Buse et ses collègues ont récemment rapporté des données biochimiques qui corroborent l’occurrence de la réticulation H240-Y244 (27). Des données EPR récentes ont également été rapportées qui indiquent la présence de radicaux tyrosyles lorsque du peroxyde est ajouté à l’enzyme au repos, bien que la ou les chaînes latérales spécifiques impliquées n’aient pas été identifiées (28, 29). Pris ensemble, ces résultats suggèrent fortement que la tyrosine réticulée est la source du quatrième électron dans l’activation et la réduction de l’O2 par la cytochrome oxydase. Cette conjecture conduit au cycle de réaction simplifié de la Fig. Figue.2,2, dans laquelle la structure H-Y réticulée est montrée explicitement et proposée pour être oxydée en radical tyrosyle neutre dans l’intermédiaire P.
Le schéma de la Fig. Figue.22 met en évidence les analogies entre la cytochrome oxydase et les peroxydases et catalases en termes de chimie du clivage de la liaison oxygène–oxygène et en termes de produits résultant de la réaction. Dans l’oxydase, l’enzyme extrait trois électrons des métaux du site actif et un quatrième électron d’une fraction organique pour réduire O2 en une étape en O⩵ et OH—. Ces deux produits sont au niveau de l’eau, bien que la protonation et la libération supplémentaires ne se produisent que dans les étapes ultérieures de la réaction. Dans les peroxydases et les catalases, l’enzyme extrait un électron d’un métal dans le site actif et un deuxième électron d’une fraction organique pour réduire H2O2 en une étape en O⩵ et OH—. Dans les peroxydases et les catalases, le produit immédiat de cette chimie est le composé I, qui contient une espèce ferryl-oxo et un radical organique. Ces structures sont exactement analogues à la structure radicalaire a34 +⩵O / qui se produit dans P dans la cytochrome oxydase. Le radical organique du composé I est réduit dans une étape ultérieure dans les enzymes peroxydase et catalase pour produire le composé II, qui maintient la structure ferryl-oxo. Dans l’oxydase, la même chimie se produit pour produire l’intermédiaire F. La similitude chimique des protéines hémiques métabolisant l’oxygène n’est apparue qu’avec la réalisation de la structure a34 +⩵O pour P et suggère que d’autres enzymes métabolisant l’oxygène peuvent suivre le même type de chimie pour activer et réduire l’oxygène et les peroxydes.
Une stratégie intéressante ressort de la Fig. Figue.22 en ce qui concerne la façon dont l’oxydase couple la chimie de l’oxygène à la pompe à protons. Les étapes de pompage ne se produisent qu’après la formation de P (8-10), ce qui signifie que l’enzyme active et réduit d’abord l’O2 en molécules d’eau de produit entièrement réduites mais incomplètement protonées; l’enzyme complète le transfert à quatre électrons des électrons à l’oxygène et stocke l’énergie libre qui se traduit par une forte oxydation de l’a34 +⩵O et des espèces radicalaires, avant d’engager la pompe. Des calculs récents sur la chimie liaison-clivage soutiennent cette idée, car les résultats indiquent que la réduction de O2 en oxo et hydroxo avec formation d’un radical et d’un ferryl-oxo est proche du thermoneutral (23). Cela représente une stratégie remarquablement efficace pour éviter les espèces d’oxygène toxiques et partiellement réduites, car aucune ne se produit dans le cycle réactionnel. De plus, en transférant l’énergie libre qui sera utilisée pour entraîner la pompe des produits d’oxygène de sous-état à la protéine, il semble que l’oxydase ait maximisé le contrôle et l’efficacité avec lesquels elle peut faire fonctionner l’appareil de translocation de protons.