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Au cours de l’étape de translocation de la phase d’élongation de la synthèse protéique, l’ARNm est avancé par un codon, couplé au mouvement des ARNT des sites ribosomiques A (aminoacyle) vers P (peptidyle) et P vers E (sortie), dans un processus catalysé par le facteur d’élongation EF-G (1). Tout d’abord, les ARNT se déplacent sur la sous-unité 50S dans des états hybrides P/E et A/P, suivis du mouvement des boucles-tiges d’anticodon d’ARNt (ASL) des sites des sous-unités 30S A et P vers les sites P et E, respectivement, couplés au mouvement de leurs codons d’ARNm associés (2). La première étape s’accompagne d’une rotation intersubunitaire (3-7), tandis que la deuxième étape nécessite EF-G · GTP, et implique la rotation du domaine de tête de la sous-unité 30S (8-11). Bien que beaucoup ait été récemment appris sur la base structurelle du mouvement de l’ARNt-P vers le site E (9, 10, 12, 13), les intermédiaires de translocation contenant de l’ARNt-A sont plus difficiles à piéger. Ainsi, une grande partie de notre réflexion sur la base structurelle du mouvement de l’ARNt et de l’ARNm a été basée sur des structures cristallines de complexes de ribosomes EF-G liés à des complexes de ribosomes vacants (14) ou contenant de l’ARNt P piégés dans des états classiques (15) ou hybrides (10, 12, 13) et deux structures cryo-EM de complexes de ribosomes EF-G des années 70 contenant deux ARNt liés dans des états hybrides P / E et A / P * (16), ou dans des états hybrides chimériques ap / P et pe/E (11 ).

Nous rapportons ici la structure cristalline d’un intermédiaire de translocation de ribosomes des années 70 contenant EF-G, un ARNm et deux ARNt – un ARNt désacylé lié à l’état pe/E et un peptidyl-ARNt piégé dans un état hybride chimérique ap/ap. Le complexe a été formé avec des ribosomes de T. thermophilus 70S, un ARNm à 39 nucléotides, un ARNt élongateur dans le site P et du N-acétyl-Val-tRNAVal dans le site A. Pour piéger l’intermédiaire de translocation, nous avons ajouté de la néomycine pour bloquer l’achèvement de la translocation et de l’acide fusidique pour empêcher la libération d’EF-G (Méthodes supplémentaires; Fig. S1). La structure a été résolue à l’aide de données de diffraction à 3,8 Å obtenues à partir d’un monocristal (tableau S1). Des exemples de densité électronique sont représentés dans des matériaux supplémentaires (Fig. S2-S13). Par rapport au ribosome à l’état classique (17), la tête de la sous-unité 30S subit une grande rotation de 21° dans le sens antihoraire, et le corps 30S une rotation de 2,7° par rapport à la sous-unité 50S (Fig. 1, Figure 2A, B). La boucle de tige de l’anticodon P-ARNt (ASL) se déplace avec la tête 30S dans une position entre le site P de la tête 30S et le site E du corps 30S (état chimérique pe; Figure 1D, E), tandis que son extrémité acceptrice se déplace complètement dans le site 50S E (Figure 1C), formant un état hybride chimérique pe/E (9-11). L’A-ARNt ASL se déplace à ~4å près des éléments du site P du corps 30S (Fig. 1D) ; son coude tourne vers le site classique 50S P, mais son extrémité acceptrice est liée entre les sites A et P de la sous-unité 50S (Fig. 1C), formant un état hybride chimérique ap/ap. La grande rotation dépendante de l’EF-G de la tête 30S dans notre structure repositionne l’hélice H38 de l’ARNr 23S, permettant au coude d’ARNt A d’atteindre la position du coude d’ARNt du site P (Fig. S14). Le domaine IV d’EF-G est coincé dans le site de convergence du codon ARNm du site A, la boucle anticodon de l’ARNt ap/ap et les ARNR 16S et 23S au pont intersubunit B2a, en contact simultané avec les quatre ARN (Fig. S15).

Bien que la rotation de la tête 30S facilite clairement la translocation de l’ASL du site P (9-11), l’ASL du site A est translocée par un mécanisme différent. L’ASL du site P se déplace avec précision avec une rotation de la tête 30S dans l’état pe / E, tandis que l’ASL du site A s’est déplacé plus loin que le mouvement de rotation de la tête dans l’état ap sur la sous-unité 30S (Fig. 1E). Le mouvement du site A ASL précisément avec la rotation de la tête entraînerait un choc sévère avec le domaine IV d’EF-G tel qu’il est positionné dans notre complexe, ce qui, associé au contact formé entre la pointe du domaine IV et l’hélice codon-anticodon de l’ARNt ap/ ap (Figure S16), suggère que le mouvement de l’ARNm et de l’ASL sont couplés à celui du domaine IV. Le déplacement supplémentaire de l’ASL ap/ ap le rapproche de l’ASL pe/E (Fig. 2C, D) (11). La position de la tête peut être stabilisée par interaction entre le phosphate 1210 de l’ARNr 16S et le domaine IV d’EF-G au niveau de Gly531.

Le plus frappant est le réarrangement de la boucle de l’ARNr 16S 966 dans la tête 30S, qui se détache du site P pour atteindre le site A, où il initie le contact avec l’ap/ap-ASL partiellement translocalisé (Fig. 2E, F). Ce réarrangement implique une perturbation du garnissage du m22G966 contre le ribose 34 du site P ASL (18, 19), et la formation d’une poche de montage en surface autour de l’ap/ap-ASL par les nucléotides A965, m22G966 et C1400. Dans une structure cristalline du complexe ARNt unique correspondent (10) (Fig. S6), l’ARNt ASL pe/E maintient tous les contacts canoniques du site P avec la tête 30S, y compris la boucle 966, lorsqu’elle tourne vers le site E. Cependant, dans le complexe à deux ARNt rapporté ici, seul un sous-ensemble des interactions de tête du site P 30S avec l’ASL pe/E est maintenu, impliquant G1338, A1339, A1340 et la queue C-terminale de la protéine uS9. La formation d’interactions post-translocation simultanément à la perturbation des interactions pré-translocation suggère un mécanisme de transmission des ASL entre les sites A et P. Il peut également représenter un déplacement initial des contacts qui doit être perturbé pour libérer l’ARNt pe/E ASL avant la rotation arrière de la tête 30S dans les étapes finales de translocation (20, 21).

Le réseau d’interactions formé entre la boucle conservée 1 (résidus 499-504) dans le domaine IV d’EF-G, l’ASL ap/ap et son codon ARNm (Fig. S15) (11) sont similaires à celles observées dans l’état post-translocation (15), ce qui suggère qu’elles sont maintenues tout au long du cycle de translocation. Leur ressemblance avec les interactions à rainure mineure effectuées par A1492 et A1493 avec l’hélice codon-anticodon dans le site de décodage (22) suggère qu’elles peuvent aider à maintenir un appariement codon-anticodon correct pendant le mouvement entre les sites A et P (15), et sont cohérentes avec la proposition selon laquelle EF-G facilite la translocation en déstabilisant les interactions dans le site de décodage 30S (23).

Des interactions entre l’ARNm et les éléments de la tête 30S dans le tunnel d’entrée d’ARNm en aval ont été proposées pour transporter l’ARNm vers l’avant avec l’ARNt pendant la rotation de la tête (17). Cependant, il n’est pas clair que le mouvement net de l’ARNm puisse être maintenu de cette manière, car ces interactions sont perturbées lors de la rotation de la tête. Nous constatons que la queue étendue de l’ARNm, lorsqu’elle émerge du tunnel aval, se courbe vers le haut pour se lier à la surface de la protéine uS3 dans la tête de la sous-unité (Fig. 3, S17). Ainsi, la rotation de la tête vers l’avant déplacerait activement l’ARNm dans le sens de la translocation. La comparaison de la position d’un nucléotide de référence sur l’ARNm à l’état tourné et non tourné montre en outre que la rotation de la tête vers l’avant ferait avancer l’ARNm d’un codon (Fig. 3D), soutenant la possibilité que l’ARNm soit activement déplacé par le ribosome lors de la translocation. Étant donné que les dimensions du tunnel aval excluent l’entrée d’une hélice d’ARN, la perturbation de la structure secondaire de l’ARNm par l’hélicase ribosomique (24) doit se produire au niveau ou à proximité de l’entrée du tunnel, par interaction avec le ribosome à l’extérieur du tunnel. La liaison de la queue d’ARNm flanquant immédiatement l’entrée du tunnel exclusivement à la tête 30S fournit une telle interaction. Les forces créées par la rotation de la tête pourraient ainsi déstabiliser l’appariement des bases dans les éléments hélicoïdaux de l’ARNm lorsqu’ils pénètrent dans le tunnel aval.

À l’état classique, C74 et C75 dans la queue CCA de l’ARNt du site P forment des paires de bases avec G2252 et G2251, respectivement, dans la boucle P (H80) de l’ARNr 23S, tandis que C75 de l’ARNt du site A se couple avec G2553 dans la boucle A (H92) (18, 25, 26). Ces interactions positionnent les groupements peptidyle et aminoacyle pour la réaction peptidyl transférase (27), qui laisse un ARNt désacylé dans le site P, et un ARNt peptidyle dans le site A. Une étape critique de la translocation est donc le déplacement ultérieur de l’extrémité peptidyl-CCA de la boucle A vers la boucle P. La structure de l’intermédiaire de translocation révèle un état chimérique, distinct de ceux décrits précédemment (Fig. S18), dans lequel l’extrémité acceptrice du peptidyl-ARNt interagit simultanément avec les boucles A et P (Figure 4). Dans cet état, l’appariement de base de C75 avec G2553 de la boucle A est conservé, tandis que le déplacement de sa tige acceptrice dans une position proche de celle de l’ARNt classique du site P permet à G2252 et G2253 dans une boucle P réarrangée de contacter le squelette de l’ARNt aux positions 72 et 70 (Fig. 4B). Ainsi, l’extrémité de la tige acceptrice de l’ARNt ap/ap est ancrée sur la boucle P, facilitant le transfert de ses résidus C74 et C75 adjacents de la boucle A vers la boucle P. A76 de l’ARNt ap/ap est orienté de manière similaire à celle observée pour l’ARNt lié à l’état classique P/P (17), avec son fragment peptidyle N-acétyl-valine positionné à l’entrée du tunnel de sortie peptidique, tandis que C74 et C75 maintiennent leurs interactions avec la boucle A de l’ARNr 23S (Fig. 4, S19).

L’extrémité acceptrice de l’ARNt ap/ap contacte simultanément les boucles A et P de l’ARNr 23S

Lors de la translocation, l’extrémité acceptrice 3′ du peptidyl-ARNt passe de l’état (A) classique A/A à l’état (B) intermédiaire ap/ap aux états (C) classiques P/P, facilitée par des changements conformationnels dans les boucles A et P.

L’ARNt ap/ap peut correspondre à des états intermédiaires qui ont été caractérisés cinétiquement. Des études cinétiques de trempe par fluorescence ont identifié un intermédiaire dépendant de l’EF-G (INT) dans lequel le coude peptidyl-ARNt se déplace du site A vers le site P, mais ne reste que partiellement réactif avec la puromycine imitant l’aminoacyl-ARNt, suggérant que son extrémité CCA n’est pas entièrement logée dans le site P (28). Les études cinétiques dans lesquelles une sonde a été fixée directement à l’extrémité CCA du peptidyl-ARNt ont identifié des intermédiaires de translocation dépendants de l’EF-G dans lesquels l’extrémité acceptrice du peptidyl-ARNt se déplace vers le site P, mais reste non réactive à la puromycine (29). Les propriétés de ces intermédiaires sont compatibles avec l’état piégé ap/ap observé ici. La structure de cet intermédiaire de translocation piégé commence à décrire comment l’ARNt se déplace entre les sites ribosomiques A et P. Les sites de liaison de l’ARNt eux-mêmes sont dynamiques, formant des contacts simultanés entre l’ARNt-A et des éléments des sites A et P, ressemblant au passage du bâton dans une course de relais (30). Cela se voit pour les sous-unités des années 30 et 50. Dans la sous-unité 30S, le réarrangement de la boucle 966 de l’ARNr 16S libère G966 du site P ASL pour entrer en contact avec le site A ASL lorsqu’il se déplace dans le site 30S P (Fig. 2E, F). Dans la sous-unité 50S, les boucles A et P de l’ARNr 23S se réorganisent pour permettre aux deux boucles de contacter l’extrémité accepteur 3′ de l’ARNt du site A lorsqu’il commence sa transition vers le site 50S P (Fig. 4). Ces résultats montrent que la dynamique structurale de l’ARN ribosomique joue un rôle actif dans le mécanisme de translocation.