Robert De Niro Sr. est né à Syracuse, New York, d’une mère irlando-américaine, Helen M. (née O’Reilly; 1899-1999). La mère d’Helen était Mary E. Burns (née de John et Mary Burns) et son père était Dennis Francis O’Reilly, né de Ellen Hall de Dundrum, la deuxième épouse d’Edward O’Reilly. Il y avait une confusion précédente au sujet de la maternité de Dennis, sa mère étant auparavant considérée comme la deuxième épouse d’Edward, Margaret.
Le père italo-américain de Robert, Henry Martin De Niro (1897-1976), est né de parents émigrés de Ferrazzano en 1887, Angelina Mercurio et Giovanni Di Niro.
Robert était l’aîné de trois enfants; lui et ses frères et sœurs John et Joan ont grandi à Syracuse, dans l’État de New York. De Niro a étudié au célèbre Black Mountain College sous la direction de Josef Albers de 1939 à 1940. Bien que l’approche très analytique de la peinture d’Albers ne fasse pas appel au style plus instinctif de De Niro, l’expérience et la perspective internationale du maître du Bauhaus ont néanmoins laissé une impression durable. De Niro a étudié avec Hans Hofmann à son école d’été de Provincetown, dans le Massachusetts. L’enseignement de Hofmann sur l’expressionnisme abstrait et le formalisme cubiste a eu une forte influence sur le développement de De Niro en tant qu’artiste mature.
À l’école d’été de Hofmann, il rencontre sa collègue Virginia Admiral, qu’il épouse en 1942. Le couple a emménagé dans un grand loft spacieux dans le Greenwich Village de New York, où ils ont pu peindre. Ils se sont entourés d’un cercle d’amis illustres, dont les écrivains Anaïs Nin et Henry Miller, le dramaturge Tennessee Williams et l’actrice et célèbre danseuse berlinoise Valeska Gert. Admiral et De Niro se sont séparés peu de temps après la naissance de leur fils Robert De Niro Jr. en août 1943 après que De Niro soit devenu gay. En 1944, De Niro a eu une relation avec le poète Robert Duncan.
Après avoir étudié avec Hans Hofmann à New York et Provincetown et Josef Albers au Black Mountain College, en Caroline du Nord à la fin des années 1930 et au début des années 1940, De Niro a travaillé pendant cinq ans au légendaire Musée d’Art Non Objectif de Hilla Rebay. En 1945, il participe à une exposition collective à l’Art of This Century de Peggy Guggenheim à New York, qui est une galerie de premier plan pour l’art des modernistes européens établis et des membres du groupe expressionniste abstrait émergent comme Jackson Pollock, Mark Rothko, Robert Motherwell et Clyfford Still. De Niro a eu sa première exposition personnelle à la galerie Guggenheim en avril et mai de l’année suivante. À ce moment-là, il travaillait principalement de manière abstraite, souvent avec des références figuratives. Une grande partie de son travail de cette période a été perdue dans un incendie d’atelier en 1949.
De Niro a eu une série d’expositions personnelles dans les années 1950 à la galerie Charles Egan à New York, qui a exposé le travail de Willem de Kooning et d’autres artistes expressionnistes abstraits du début. Les critiques ont salué les compositions de DeNiro remplies de zones improvisées de couleurs vives qui ont cédé la place à des natures mortes vaguement peintes et à des nus tout en courbes. Au milieu des années 1950, De Niro participe régulièrement à d’importantes expositions collectives telles que le Whitney Annual, le Stable Annual et le Musée juif. Il a reçu un prix de la Fondation Longview en 1958.
De 1961 à 1964, De Niro voyage en France pour peindre à Paris et dans la campagne environnante. Le collectionneur Joseph Hirshhorn a acheté un certain nombre de peintures et d’œuvres sur papier de l’artiste au cours de cette période par l’intermédiaire de la galeriste de De Niro, Virginia Zabriskie, qui font maintenant partie de la collection permanente du Hirshhorn Museum and Sculpture Garden à Washington, DC. En 1968, il a reçu une bourse Guggenheim.