Effekt av kolesterol på strukturen av et fosfolipid dobbeltlag

Nøkkelord:

• biomembran
• molekylær simulering
• fase oppførsel
• dimyristoylfosfatidylkolin
• mesoskopisk modell

i denne artikkelen tar vi opp et tilsynelatende enkelt termodynamisk spørsmål: hvordan endres området per molekyl av en fosfolipidmembran hvis vi legger til kolesterol? Dette spørsmålet ble først utgitt Av Lær (1) i 1925 og diskuteres fortsatt i dag. Betydningen av dette spørsmålet er direkte knyttet til betydningen av kolesterol for funksjonen av membraner av høyere eukaryoter. For eksempel regulerer kolesterol fluiditeten til membranen og modulerer funksjonen av membranproteiner (2). Å forstå disse mekanismene har motivert mange forskere til å undersøke lipid-kolesterol-interaksjonene i detalj. Fordi en membran kan ses SOM EN 2d-væske, vil et første estimat av hvordan området per molekyl ville forandre seg ved tilsetning av kolesterol være å anta ideell blanding, hvor området per molekyl bare er et vektet gjennomsnitt av de rene komponentene. I 1925 Viste Leathes at man i stedet for ideell blanding observerer en slående nonideal oppførsel (1). Denne ikke-ideale oppførselen kalles kondenserende effekt (3) fordi området per molekyl er mye lavere sammenlignet med ideell blanding. Fordi en membran oppfører seg som en inkompressibel væske, vil en reduksjon av området per molekyl resultere i en tilsvarende signifikant økning av den totale tykkelsen av dobbeltlaget. En slik økning av tykkelsen signalerer en omorganisering av membranets struktur. Fordi endringer i membranets struktur kan ha viktige konsekvenser for proteinenes funksjon (2), er det viktig å ha en bedre molekylær forståelse av de kolesterolinduserte endringene.Ulike konseptuelle modeller har blitt foreslått for å forklare nonideal kolesterol-lipid interaksjoner. Eksempler er kondensert-komplekser modell (4, 5), superlattice modell (6), og paraply modell (7). Kondenserte komplekser-modellen forklarer kondenseringseffekten ved å anta at kolesterol induserer reversibel dannelse av et støkiometrisk kolesterol-lipidkompleks. I et slikt kompleks kondenseres membranen ettersom lipidacylkjedene er mer bestilt. Ved en gitt kolesterolkonsentrasjon eksisterer en likevektssammensetning mellom disse kondenserte kolesterol-lipidkompleksene og vanlige lipider. Superlattice-modellen antar at kolesterolmolekylene ved kritiske konsentrasjoner utviser en bestemt langvarig rekkefølge. Paraplymodellen mener at den hydrofile delen av kolesterol er for liten, og derfor må lipidene bidra til screening av kolesterolmolekylene fra hydrofobe interaksjoner med vann. Fosfolipidene kan bare skape denne paraplyen hvis disse molekylene retter seg for å gi plass til kolesterol. I disse modellene er de underliggende mekanismene som fører til kondensering svært forskjellige. Interessant, en fersk eksperimentell studie konkluderte med at deres data støttet kondensert-komplekser modell (8), mens et annet sett av eksperimenter fant ingen indikasjon på kondensert komplekser og støttet paraply modell (9). Disse forskjellene i innsikt motiverte oss til å utvikle en mesoskopisk modell av et lipid–kolesterol–vannsystem. Vi brukte molekylære simuleringer for å kaste lys over den laterale organiseringen av kolesterol i lipidmembraner og de underliggende lipid-kolesterol-interaksjonene som induserer kondenseringseffekten.Flere molekylære simuleringer av all-atom og grovkornede modeller av kolesterol i lipid bilayers har blitt rapportert i litteraturen (for noen nyere eksempler, se refs. 10-13 og referanser deri). Ideelt sett vil man gjerne bruke all-atom simuleringer for å studere kondenserende effekt over et stort utvalg av temperaturer og komposisjoner. I dag er imidlertid disse simuleringene for tidkrevende. Derfor bruker vi en grovkornet modell, hvor effektivitet oppnås ved å integrere ut noen av detaljene i en all-atommodell. Vår modell er basert på Modellen Til Kranenburg og kollegaer (14 ,15). Modellen bruker eksplisitte vannmolekyler. Lipider og kolesterol består av hydrofile og hydrofobe partikler (Se Fig. 1). Denne modellen klumper grupper av atomer i ett mesoskopisk pseudoatom. De intramolekylære interaksjonene inkluderer bindingsvibrasjoner og bindingsbøyning hvor parametrene er optimalisert for å etterligne strukturen til et enkelt all-atom fosfatidylkolinmolekyl i vann. De hydrofile og hydrofobe interaksjonene er beskrevet med myke repulsive interaksjoner, og parametrene for disse interaksjonene er relatert til oppløselighetsparametrene ved å bruke metoden beskrevet Av Groot og Rabone (16). Ideen med denne modellen er at de viktigste drivkreftene i kolesterol-fosfolipidblanding er de hydrofobe og de hydrofile interaksjonene, som er konklusjonen av mange eksperimentelle studier (7, 9, 17). I vår modell er lengdeenheten direkte relatert til den effektive størrelsen på et pseudoatom, dvs. et pseudoatom opptar et volum på 90 Å3. Energienheten følger av matchingen av mykavstøtningsparametrene til mesoskopiske vannpartikler til komprimerbarheten av vann ved omgivende forhold. Enkelheten til modellene krever en reparameterisering av disse myke avstøtningene hvis temperaturen endres. I dette arbeidet antar vi imidlertid at parametrene er uavhengige av temperaturen. Temperaturskalaen er satt ved å passe til eksperimentelle faseovergangstemperaturer. Ytterligere detaljer og anvendelser av denne modellen finnes i ref. 18.

vår modell av kolesterol, vist I Fig. 1B, er basert på de samme antagelsene om effektiv størrelse og interaksjoner som lipidmodellen. Etter McMullen et al. (19), gjorde vi den hydrofobe delen av kolesterolmodellen litt lenger enn den hydrofobe delen av lipidmodellen, som har som mål å representere dimyristoylfosfatidylkolin (DMPC). For enkelhets skyld har vi antatt at de hydrofobe og hydrofile interaksjonene av et kolesterolmolekyl er lik de i en lipid. For å få innsikt i den molekylære mekanismen for kondenserende effekten av kolesterol, har vi introdusert tre kolesterollignende molekyler der vi forstyrrer den hydrofobe hydrofile balansen i molekylet: en der vi reduserer den hydrofobe halelengden (Se Fig. 1C), en der vi legger til en ekstra hydrofob gruppe(Fig. 1D), og en der vi erstatter ringen med en enkel kjede(Fig. 1E).

Fig. 2 viser den beregnede temperatursammensetningsfasediagrammet for vann-fosfolipid-kolesterolsystemet. Fasegrensene ble oppnådd ved en visuell inspeksjon av øyeblikksbildene og, mer kvantitativt, fra bøyningspunktene til kurvene som gir området per lipid, den gjennomsnittlige hydrofobe tykkelsen av membranen og halerekkefølgen og vippeparametrene. Disse egenskapene ble beregnet som en funksjon av temperatur og kolesterolinnhold.

La oss først fokusere på ren-lipidfasene, og effekten av kolesterol vil bli diskutert neste. For det rene lipid-dobbeltlaget er fasediagrammet beregnet av Kranenburg og Smit (14) for et system som er fire ganger mindre. Vi brukte samme metode for å lokalisere fasegrensene som Kranenburg og Smit gjorde (14). Våre resultater er i utmerket samsvar med denne studien, noe som indikerer at de endelige størrelseseffektene er små. For det rene fosfolipidet observerer vi ved høye temperaturer en væskefase (La) der haler er uordnet. Ved lave temperaturer bestilles haler og vippes, som definerer gelfasen (L ‘ c). Disse to fasene separeres av den ripplede fasen (P’β), hvor vi observerer en mikrofaseparasjon av domener der dobbeltlaget er tykt og lipidene er bestilt og domener der dobbeltlaget er tynt og lipidene uordnet. Tilstedeværelsen av disse tre faser indikerer at det resulterende fasediagrammet er i meget god avtale med det eksperimentelle diagrammet av det rene lipidet (20). Temperaturskalaen er satt ved å matche temperaturene i faseovergangene til gelfasen til rippefasen (Tp) og rippefasen til væskefasen (Tm) med de tilsvarende eksperimentelle faseovergangstemperaturene for ren DMPC. En ytterligere sammenligning med eksperimentelle data er laget for gjennomsnittlig areal per molekyl av dobbeltlaget(Fig. 3A), for dobbeltlagstykkelsen (Fig. 4A), og for lipid hale rekkefølge (Fig. 4B). For området per lipid får vi 56 Å 2 per molekyl sammenlignet med den eksperimentelle (21) 60 Å 2 per molekyl. For dobbeltlagstykkelsen beregnet vi en verdi på 38,7 Å, som sammenligner godt med eksperimentell verdi på 36 Å (21), og en lignende avtale er oppnådd for halerekkefølgen (Se Fig. 4B). For å beregne området per molekyl for rent kolesterol simulerte vi et dobbeltlag av rent kolesterol. Vi oppnådde en verdi på 40.3 Å, som sammenligner veldig bra med den nyeste eksperimentelle verdien av 41 Å (22) for et monolag av kolesterol. Med tanke på tilnærmingene i vår modell, er avtalen mellom eksperimentelle og simulerte verdier overraskende god.

la oss nå vende oss til effekten av kolesterol på egenskapene til dobbeltlaget. Det første spørsmålet vi vil ta opp er om vår modell kan gjengi kondensasjonseffekten. Fig. 3A viser effekten av kolesterol på området per molekyl som en funksjon av kolesterolkonsentrasjonen. Sammenligning med eksperimentelle data viser igjen veldig god avtale. I denne figuren viser vi også området per molekyl som antar ideell blanding. Denne figuren illustrerer overbevisende kondensasjonseffekten; området per molekyl reduseres mye mer enn man forventer på grunnlag av ideell blanding. Andre eksperimentelle data inkluderer effekten av kolesterol på dobbeltlaget hevelse (Fig. 4A) og halerekkefølgeparameteren (Fig. 4B). Både eksperimentelle data og simuleringen viser at kolesterol øker tykkelsen på dobbeltlaget og dens rekkefølge. Også for disse to egenskapene er våre simuleringsresultater i meget god avtale med eksperimentelle data. Simulerings-og eksperimentelle data (Figs. 3A og 4 A og B) viser at tilsetningen av kolesterol sterkt endrer egenskapene til lipid-dobbeltlaget opp til ±30 mol% kolesterol. Etter dette nås en region hvor ytterligere tilsetning av kolesterol bare har en liten effekt. Ved 30 mol % kolesterol har både området per molekyl og lipidhale rekkefølge og tilt parametere verdier som er typiske for gelfasen.

fargekodingen I Fig. 2 viser forskjellen mellom det simulerte området per lipid og verdien estimert ved å anta ideell blanding. Vi observerer at ved høye og lave temperaturer er kondenseringseffekten relativt liten. Kondenseringseffekten er maksimal i en veldefinert region i faserom som ligger like over hovedfaseovergangen av det rene fosfolipidet. For å forstå bedre arten av kondenseringseffekten, er det viktig å forstå effekten av å legge til kolesterol på membranets faseadferd.

Fig. 2 viser de viktigste funksjonene i fasediagrammet. De forskjellige fasene vi observerte i våre simuleringer har også blitt observert eksperimentelt, men ikke alltid for den spesifikke blandingen AV DMPC og kolesterol (20, 23, 24). De ulike eksperimentelle studiene viser imidlertid kvalitativt svært forskjellige fasediagrammer, noe som begrenser våre muligheter til å gjøre en detaljert sammenligning. Snapshots av de ulike fasene kan bli funnet I Fig. 5.

ved svært høye temperaturer har tilsetningen av opptil 50 mol% kolesterol liten effekt på membranstrukturen, og Vi observerer La-fasen for alle konsentrasjoner (24). Ved temperaturer under Tp observerer vi at kolesterol endrer strukturen i gelfasen ved å hemme hellingen av lipidhaler, noe som forårsaker dannelsen Av l ‘ c-fasen (20) (sammenlign Fig. 5 d med E). Ved høyere kolesterolkonsentrasjoner (> 20%) observerer vi dannelsen av små kolesterolrike klynger. VI betegner DENNE fasen AV LII, og denne fasen er vist I Fig. 5E. ved temperaturer Mellom Tp og Tm er det rene dobbeltlaget i krusningsfasen, og kolesterol forvandler denne krusningsfasen (Se Fig. 5C) i en væskeordnet fase (23) (Fig. 5B). Begrepet flytende bestilt fase ble introdusert Av Ipsen et al. (25). Tykkelsen på dobbeltlaget er mellomliggende mellom tykkelsen av væsken og gelfasen. Lipidhale-ordensparametrene har verdier som er nær gelfasen; men i motsetning til gelfasen er lipidene mer uordnede og vipper ikke. Kolesterol øker gradvis temperaturen Der La Til Lo-faseovergangen oppstår. Ved svært høye kolesterolkonsentrasjoner forvandles den væskebestilte fasen til en gelfase (LII) når temperaturen senkes under Tm. Denne fasen har blitt observert eksperimentelt for dipalmitoylfosfatidylkolin (26), men vi har ikke funnet eksperimentelle data FOR DMPC ved disse forholdene. La oss nå gå tilbake til kondensasjonseffekten. Fig. 2 viser at kondenseringseffekten er maksimal ved en temperatur like over hovedovergang Tm. Årsaken er at ved disse forholdene er det rene dobbeltlaget i en væskeforstyrret tilstand, mens tilsetningen av kolesterol til dobbeltlaget forvandler det til en væskeordnet fase, som har et område per lipid som er mye mindre sammenlignet med væskeforstyrret tilstand. Denne store forskjellen gir en stor kondensasjonseffekt. Ved høyere temperaturer forblir væskefasen stabil for alle kolesterolkonsentrasjoner, noe som gir en mye mindre kondenseringseffekt. Ved lavere temperaturer har det rene lipid-dobbeltlaget et område per lipid som er mye nærmere området per lipid i den væskebestilte fasen, og som et resultat er kondenseringseffekten langt mindre.

resultatene ovenfor indikerer at kondenseringseffekten er en direkte konsekvens av bestemte endringer i faseadferd som kolesterol induserer. I litteraturen er det ulike spekulasjoner om de aspektene av kolesterolstrukturen som er spesielt ansvarlige for kondenseringseffekten. For eksempel er paraplymodellen basert på ideen om at sammenlignet med fosfolipider, er den hydrofile delen av kolesterol mye mindre og trenger fosfolipidet, som en paraply, for ytterligere screening fra samspill med vann. Dette antyder at en ekstra hydrofil gruppe vil endre egenskapene helt. En annen viktig faktor er den store ringstrukturen; hvis vi erstatter ringen med en hale, får vi et molekyl som ligner mer et alkoholmolekyl (27). Imidlertid vil forkortelse av den hydrofobe halen ha liten effekt. Fig. 1 viser de modifiserte kolesterolmolekylene som etterligner disse endringene. Faktisk resultatene I Fig. 3B viser at forkorte halen av kolesterol viser samme kondenseringseffekt. Men Fig. 3B viser at for begge andre modifikasjoner av kolesterolmolekylet, tilsetning av en ekstra hydrofil gruppe og erstatning av ringen med en lineær kjede, observeres ingen kondenserende effekt. Vi observerer motsatt effekt: tilsetning av disse molekylene fører til at dobbeltlaget blir mer utvidet sammenlignet med ideell blanding. Effekten av (mindre) alkoholer på området per molekyl er målt eksperimentelt, og eksperimentelle data viser også en økning (28). Nært knyttet til dette observerte vi at for begge tilfeller i fasediagrammet var væskefasen stabil over hele konsentrasjonsområdet. Faktisk observerer vi at tilsetning av disse molekylene reduserer hovedovergangstemperaturen, og derfor er det ingen region i fasediagrammet der det er stor kondensasjonseffekt.Simuleringer med disse strukturelle variasjonene av kolesterol indikerer hvor overraskende subtil mekanismen er. Hovedovergangen i et rent dobbeltlag er svært følsomt for de hydrofobe interaksjonene. Hovedgruppene av lipidene skjermer de hydrofobe haler fra vannet. Ved høye temperaturer er området per lipid høyt, og denne screeningen er langt fra optimal; men ved disse forholdene dominerer kjedens entropi. Ved å redusere temperaturen blir det stadig viktigere å skjerme de hydrofobe interaksjonene, og ved hovedovergangen induserer det til slutt en bestilling av kjedene. Et viktig aspekt er å forstå hvordan kolesterol destabiliserer væskefasen. Kolesterol har et mindre hydrofilt hode og er derfor mindre effektivt for å beskytte de hydrofobe interaksjonene. Ved høye temperaturer kan lipid-dobbeltlaget imøtekomme dette, men ved lavere temperaturer kan lipidene bare bidra til screening av kolesterolet ved å redusere sitt område per lipid. Dette fører til observert bestilling og forklarer hvorfor hovedovergangen øker. De to endringene vi introduserte til kolesterolstrukturen påvirker dens hydrofobe screening; i begge varianter forsvinner den iboende undershielding av kolesterol. Hvis disse molekylene legges til dobbeltlaget, er det ikke behov for ytterligere screening av de hydrofobe interaksjonene, og disse molekylene forhindrer dannelsen av en bestilt fase.

la oss sammenligne våre observasjoner med tidligere modeller som er innført for å forklare kondenseringseffekten. For det første gir vår modell ingen indikasjon på langtrekkende bestilling som antas i superlattice-modellen. Implisitt i både paraplymodellen og de kondenserte kompleksene er antagelsen om en slags lokal organisasjon. For eksempel, i paraplymodellen antas det at ett lipidmolekyl kunne skjerme ett eller to nærliggende kolesterolmolekyler (se f.eks. 2). Våre simuleringer viser en mye mer uordnet struktur der vi ikke kan identifisere disse bestilte strukturer. På dette punktet er det viktig å huske at vår modell inneholder mange forutsetninger, og dette reiser spørsmålet om konklusjonene vi trekker fra våre simuleringer er relevante for de eksperimentelle systemene. Vi var veldig overrasket over å se at vi var i stand til å oppnå en så rik faseadferd ved å bruke en grovkornet modell som bruker rent repulsive krefter. Vår modell gir en svært rimelig kvantitativ beskrivelse av nyere eksperimentelle data på strukturen av dobbeltlaget. Det andre interessante er at våre beregninger forutsier at kondenseringseffekten er maksimal i et smalt temperaturområde over hovedovergangen. Det kan være mulig å verifisere dette eksperimentelt. En meget streng test av vår modell ville ha vært en detaljert sammenligning med eksperimentell fasediagram. I denne sammenheng er det oppmuntrende at fasene vi har funnet har blitt observert eksperimentelt, men ikke alltid for nøyaktig systemet simulert. Ved å nøye velge de eksperimentelle dataene som er enige med våre simuleringer, kan vi til og med kreve veldig god avtale. En mulig årsak til uenigheten mellom de ulike forsøkene er at forskjellige teknikker brukes, og ikke alle teknikker er like følsomme for forskjellene i strukturen i de ulike faser. Vi håper at kombinasjonen av et fasediagram og detaljert informasjon om strukturen i de ulike fasene gir noen retningslinjer for om en bestemt eksperimentell teknikk kan identifisere en bestemt faseovergang.