alle metoder ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter. Informert samtykke ble innhentet fra alle fag.
Materiale
følgende sølvbandasjer ble sammenlignet: Acticoat (Smith &Nevø, STORBRITANNIA; referert til I denne artikkelen Som Ac), Aquacel Ag + Extra (Convatec, STORBRITANNIA; referert Til I denne artikkelen Som Aq), Silvercel Hydroalginat (Systagenix, STORBRITANNIA; ialugen Plus (IBI, tsjekkia; referert til i denne artikkelen Som Ia).
Andre kjemikalier ble hentet Fra Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) hvis ikke annet er oppgitt.
Fremstilling av ekstrakter
i flere analyser ble ekstrakter fra dressinger brukt i stedet for dressingene selv. Disse ekstraktene ble fremstilt ved bruk av fysiologisk saltvann (0,9% (w / v) NaCl) eller cellekulturmedier supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Forholdet mellom dressingområdet og oppløsningen var 1 cm2 per 4 mL oppløsning. Ekstraksjon ble utført for 72 h VED RT med konstant omrøring. Ekstraktene ble sterilisert ved å sende dem gjennom et 0,2 µ filter og lagret hos 4 °C til bruk.
Sølvkonsentrasjonsmåling
sølvkonsentrasjonene i dressinger og ekstrakter av dressinger ble målt VED BRUK AV ICP-OER. Sølvkonsentrasjonen ble også evaluert i ex vivo hudprøver hos svin. 10-70 mg av hver prøve ble overført TIL ET PTFE-fartøy for mikrobølgefordøyelse. Deretter, 1 mL konsentrert salpetersyre (spor analyse klasse, Analytika Ltd., Tsjekkia), 0.8 mL konsentrert saltsyre (trace analysis grade, Analytika Ltd., Tsjekkia) og 0,2 mL hydrogenperoksid (p.a. 30%, Penta Ltd., Tsjekkia) ble lagt til. Prøven ble fordøyd ved 150 °C i 5 minutter og deretter, i det andre trinnet i samme syklus, ved 200 °C i 10 minutter. Etter fordøyelsen ble prøven kvantitativt overført ved bruk av 0,2 mL hydrogenperoksid og deionisert vann.analysen ble utført MED ET ICP-OES-instrument (Radial 725, Agilent Technologies, Australia) utstyrt med en pneumatisk Sjøsprøyt nebulisator og syklonisk sprøytekammer. Kvantifisering var basert på ekstern kalibrering. Metode nøyaktighet og pålitelighet ble testet ved bruk av svin hudprøver spiked med kjente konsentrasjoner Av Ag fra en sertifisert referanseløsning (Analytika Ltd., Tsjekkia).
Scanning elektronmikroskopi
Scanning elektronmikroskopi (SEM) analyser ble utført ved Hjelp Av En Zeiss Ultra Plus instrument (Zeiss, Tyskland). Prøver ble belagt med et tynt lag Av Au / Pd i Et Quorum SC7620 sputter coater. Bildene ble tatt av to sekundære InLens og se2 elektron detektorer for høyere eller lavere forstørrelse, henholdsvis. Skanneparametere var som følger: akselererende spenning, 3,5 kV; sonde strøm, 36 pA; og trykk i kammeret, ~ 7 × 10-5 Pa.
EDX-bilder ble tatt med Zeiss Ultra Plus-instrumentet. Røntgenkart og spektra ble tatt av En x-MaxN 80 Røntgendetektor (Oxford Instruments, UK). EDX-parametrene var som følger: akselererende spenning, 10 kV; sondestrøm, 300 pA; arbeidsavstand, 8,5 mm; og prosesstid, 4 .
direkte oksidativ aktivitet av dressinger
genereringen AV ROS i cellefrie forhold ble evaluert ved bruk av 3,3′,5,5′-tetrametylbenzidin (TMB) som substrat for pepperrotperoksidase (HRP). Sirkler med diameter 6 mm ble kuttet ut av dressingene og testet. Kort fortalt besto arbeidsløsningen av 0,1 mg/mL TMB (stamoppløsning c = 1 mg/mL I DMSO) blandet 1:9 med 0,05 m citratfosfatbuffer (pH = 5) og HRP (endelig c = 0,16 IE / mL). Hvert bandasjestykke ble nedsenket i 0,5 mL av arbeidsløsningen, og prøver (25 µ) ble samlet ved 0, 5, 7,5 og 10 min. Umiddelbart etter innsamling ble prøvene blandet i forholdet 1: 1 med 0,16 M H2SO4 og absorbans ble lest ved 450 nm (referansebølgelengde = 540 nm) ved hjelp Av Et NanoDrop OneC-instrument (ThermoFisher Scientific, USA). 30% H2O2 ble brukt som en positiv kontroll. Bakgrunnssignalet (blank løsning) ble trukket fra.
sølvpenetrasjon i epitelisert hud
vi brukte statiske diffusjons Franz-celler for å undersøke sølvpenetrasjon i epitelisert hud. Huden ble hentet fra et lokalt slakteri (Bocus, Letohrad, tsjekkia) og skåret ut fra den indre delen av svinekjøttet. Håret ble barbert, huden ble inkubert I PBS (60 °C, 90 s), og epidermis ble avskallet. Den gjennomsnittlige tykkelsen på den epiteliserte huden var 2 mm. hudbitene ble plassert i et kammer og dekket med en testet sølv dressing eller et stykke gassbind. Hvert donorkammer ble fylt med 0,3 mL NHDF kulturmedium med 10% FBS. Akseptorkammeret inneholdt 0,7 mL kulturmedium. Diffusjonscellene ble inkubert ved 37 °C i 24 eller 48 timer. Etter inkubasjon ble huden skyllet MED PBS, og delene av huden som separerte donor-og akseptorkamrene ble analysert for sølvinnhold ved HJELP AV ICP-OER, som beskrevet ovenfor. Mengden sølv som trengte gjennom den epiteliserte huden ble målt i donorvæsken. Tre uavhengige replikater ble utarbeidet begge ganger.
Dyrking av ex vivo hud med dressinger
Friske (1-2 h) svin aurikler (Bocus) ble nøye rengjort med såpe Og Betadin (EN PVP jodoppløsning, Egis Pharma, Ungarn) og skyllet med vann. Hudbitene (1 × 1 cm) fra aurikler ble skåret ut og plassert i antibiotikaløsning (penicillin-streptomycin-oppløsning, 10 000 E/mL penicillin, 10 mg / mL streptomycin) i 30 minutter ved 37 °C under atmosfærisk O2 og CO2. Hudprøver med intakt epidermis ble plassert på hudsiden oppover i 6-brønnsplater med 3 mL NHDF medium supplert med 10% FBS og deretter dekket med 1 × 1 cm av valgt sølvholdig dressing eller steril kontrollgass fuktet med 300 µ av dyrkingsmedium. Prøvene ble inkubert i 24 eller 48 timer. Etterpå ble huden skyllet MED PBS, og hver av hudeksplantatene ble delt inn i tredjedeler for histologisk undersøkelse (4% pfa-fiksering ved 4 °C), proteinanalyse Ved Hjelp Av Western blot( snapfrysing med flytende nitrogen) og qPCR (overnatting i RNAlater (Thermo Fisher Scientific), deretter ved-80 °C).
Histologisk farging
den automatiske fargingen av sølv ble vedtatt i Henhold Til Danscher et al.49. Bildene ble tatt med Et Eclipse 50i-mikroskop med ET VEDLAGT DS-Fi1-kamera (Nikon, Yokohama-Shi, Japan).for immunfluorescens av yH2AX ble histologiske seksjoner På Superfrost Pluss glassglass (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) deparaffinisert og inkubert over natten med primært antistoff (1: 1,000, ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, clone JBW301, Millipore, MA, USA). De ble deretter inkubert i 1 h med et sekundært antistoff (ab150114, Abcam, Cambridge, STORBRITANNIA; fortynning 1: 10 000) og montert på lysbilder Med ProLong Diamond Antifade Mountant med Dapi (ThermoFisher Scientific). Bildene ble tatt Med Et Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japan) fluorescerende mikroskop.
Genuttrykk
Svinehud etter inkubasjon med dressinger ble behandlet for RNA-isolasjon, cDNA-syntese og qPCR-genuttrykk som beskrevet tidligere Av Klein et al.50 TaqMan Sanntids PCR-Analyser (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) brukt for qPCR var: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; Hsph1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. Terskelsyklusverdier ble normalisert TIL rpl13a-husholdningsgenet og relatert til gasbindkontrollprøver for den bestemte tiden (24-eller 48-h-intervallet) ved bruk av 2-Δδ Metode51. Seks uavhengige prøver for hver behandling og tid ble målt og i gjennomsnitt. Betydningen av forskjeller i genuttrykk i forhold til gasbindkontroll ble evaluert ved Hjelp Av Studentens t-test for hver sølvbandasje i den angitte tiden.
Western blotting
for påfølgende Western blot analyse ble vev lysater fremstilt fra frossen svineskinn. Bruke en skalpell i en dråpe lysisbuffer (50 Mm Tris pH 8; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% natriumdeoksykolat; 1% natriumdodecylsulfat; 4% urea), ble huden kuttet i små stykker, som deretter ble homogenisert i 350 µ av lysisbufferen ved hjelp av en rustfritt stål 5 mm perle og en vevshomogenisator (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Tyskland) i 10 Min ved 25 Hz. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved HJELP AV bca protein assay kit (Thermo Fisher Scientific).
Proteiner i lysater ble separert ved hjelp av 4-15% gradient SDS-SIDE og overført til polyvinylidendifluoridmembraner. For å oppdage spesifikke proteiner ble membraner inkubert over natten i en blokkeringsbuffer (20 mM Tris; 137 mM NaCl; 0,05% Tween 20; 5% tørket fettfattig melkepulver) med det primære antistoffet fosfohiston H2A.X (20E3) (1:1000; Cellesignalering, USA). β-actin ble brukt som en proteinmengde lastekontroll (1: 2000; Santa Cruz, USA). Membranene ble utviklet MED HRP-konjugert anti-kanin eller anti-mus Ig ved hjelp av kjemiluminescerende deteksjon for å visualisere signaler (Clarity Western ECL substrate; Bio-Rad, USA). Signalene ble skannet og evaluert med Et Alliance 9.7 Chroma Chemiluminescence Imaging System (UVItec Limited, STORBRITANNIA).
Antibakteriell aktivitet
agardiffusjonsmetoden ble brukt til å sammenligne de antimikrobielle aktivitetene til dressingene. Et prøvestykke (1 cm2) av hver bandasje ble inkubert på en fersk inokulert Petriskål med Enten Staphylococcus aureus eller Pseudomonas aeruginosa; disse stammene ble isolert fra humane kroniske sår, karakterisert og dyrket som beskrevet tidligere52. I tillegg ble den antimikrobielle effektiviteten til bandasjeekstrakter (fremstilt I RPMI-medium med 10% FBS, som beskrevet ovenfor) sammenlignet ved hjelp av mikrofortynningsmetoden53. Optisk tetthet ble målt Ved En Ensight Multimodeplateleser (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) ved 600 nm i 24 timer (risting, 37 °C).
Cellekultur
Normale humane dermale fibroblaster fra voksen hud (NHDF) ble kjøpt fra Lonza (Basel, Sveits). NHDF ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles lavglukosemedium (DMEM) supplert med 10% FBS, glutamin (0,3 mg/mL), glukose (4 mg/mL), penicillin (100 enheter/mL) og streptomycin (0,1 mg/mL) i 75 cm2 kulturflasker under 5% CO2 og ved 37 °C til femte passasje. HaCaT keratinocytter ble kjøpt fra Hö Diagnostika (Kö, Tyskland) og ble dyrket på samme måte, men uten tilsetning av glukose til mediet.
Levedyktighetsmåling
Fem tusen celler per brønn ble sådd i en 96-brønnplate med 200 µ av kulturmediet med 10% FBS i en inkubator (37 °C, 5% CO2) over natten. Dagen etter ble cellene behandlet med 200 µ i en fortynningsserie med ekstrakter fra bandasjene (100%, 50%, 20%, eller 10% av det opprinnelige ekstraktet fortynnet med kulturmedium supplert med 10% FBS) for 24, 48 og 72 h. Kontrollceller ble behandlet med et standard 10% fbs kulturmedium. Levedyktighet ble målt som beskrevet tidligere54 ved bruk av 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid (MTT) – analysen. Mtt-lagerløsning (20 µ; c = 5 mg / mL) ble tilsatt til cellekulturmediet i hver brønn. Platene ble inkubert i 2,5 timer ved 37 °C. DERETTER ble MTT-oppløsningen fjernet, 220 µ lysisoppløsning (1:1 propan-2-ol med DMSO, 10% (w/v) Triton X-100 og 0,37% (w/v) HCl) ble tilsatt, og lysis ble utført i 30 min ved romtemperatur på en roterende shaker (150 rpm). Absorbansen ble lest ved 570 og 690 nm med En EnSight Multimode Plateleser (PerkinElmer, USA). Data ble behandlet I Kaleido (PerkinElmer, USA). Den endelige absorbansen ble beregnet Som A = A570-A690. Endringen i levedyktighet av behandlede celler i forhold til kontrollceller ble beregnet som endring = (en prøve / en kontroll-1) × 100.
direkte kontakthemningsanalyse
Celler ble sådd med en tetthet på 300 000 celler per brønn i en 6-brønnplate og inkubert i kulturmediet supplert med 10% FBS ved 37 °C og under 5% CO2 til konfluens ble oppnådd. Forbindinger ble kuttet i firkanter på 1 cm2, plassert på cellelaget og inkubert med standardkulturmediet i 6 h. Kontrollceller ble behandlet med kun mediet. Etterpå ble cellene vasket MED PBS og festet med 4% paraformaldehyd i 15 min. Cellene ble farget med 0,1% (w/v) krystallfiolett løsning (oppløst i 10% etanol) i en time og deretter skyllet med vann. Inhiberingssonene ble fotografert med Et Canon eos 80D EF-s 18-55 mm f digitalkamera (Canon).
Fluorescerende farging av celler
FOR DNA-skadeanalyse ble NHDF-celler sådd på mikroskopiske lysbilder i en 6-brønnplate med en tetthet 2 × 105 per brønn og tillatt å feste seg over natten. Dagen etter ble cellene behandlet med 5 × fortynnede bandasjeekstrakter og inkubert i 24 timer. deretter ble cellene løst ved bruk av 4% PFA i 15 minutter. Etter permeabilisering og blokkering ble lysbildene inkubert med et anti-yh2ax kanin primært antistoff (Cellesignalering, USA; 1:500 fortynning i en blokkeringsbuffer-20% FBS, 0,3 m glycin, 0,05% Tween 20 I PBS; over natten; 4 °C). Deteksjon ble utført ved bruk av et sekundært antistoff merket Med Alexa Fluor 555 (Abcam, UK; 1:500 i en blokkeringsbuffer; 1 h, RT). Lysbildene ble montert Ved Hjelp Av ProLong Diamond Antifade Mountant med Dapi (ThermoFisher Scientific). Etter at lysbildene ble tørket, ble bilder tatt ved Hjelp Av Et Eclipse Ti fluorescerende mikroskop (Nikon, Yokohama-Shi, Japan).Intracellulært oksidativt stress ble påvist ved HJELP AV EN dcf-da-sonde, som er følsom for DEN totale ROS-konsentrasjonen inne i celler. Cellene ble sådd over natten i en 24-brønnsplate og deretter merket MED DCF-DA (1 µ/mL) i 15 min.deretter ble de behandlet med 5 × fortynnede bandasjeekstrakter og inkubert ved 37 °C og under 5% CO2. 5 mM H2O2 ble brukt som en positiv kontroll. Den grønne fluorescensen AV DCF ble registrert hvert 15. minutt i løpet av en 90 min inkubasjonsperiode ved Hjelp Av Et Incucyte s3 automatisert mikroskop (Essen Bioscience, USA). Kvantifiseringen av intracellulær fluorescens ble utført i Fiji-programvare etter metoden beskrevet av Č 55.
Bestemmelse av oksidativ burst av nøytrofiler i fullblod
en uavhengig etikkutvalg godkjente blodprøveinnsamlingen for nøytrofil oksidativ burstanalyse og MAT (Etisk Utvalg For Forskning Ved Masaryk University, Brno, Tsjekkia, godkjenning nr. EKV-2018-083). Alle givere ga sitt skriftlige samtykke.den oksidative burst (ROS produksjon) av blod fagocytter ble bestemt i fortynnet fullblod ved luminol-forbedret kjemiluminescens (CL) ved HJELP AV EN LM-01T mikro luminometer (Immunotech, tsjekkia). Kort fortalt besto reaksjonsblandingen av 6 ④l fullblod i 54 µ AV RPMI-1640 vekstmedium blandet med 60 µ av bandasjeekstrakt i fysiologisk saltvann eller ET fbs-supplert medium. Denne blandingen ble inkubert ved 37 °C i 20 min. Like før målingen startet, la vi til 1 mM luminol (en lagerløsning på 10 mM luminol i en 0,2 M boratbuffer) (Molekylære Prober, USA). Vi bestemte spontan ROS-produksjon, OG ROS-produksjon indusert av opsoniserte zymosanpartikler (OZP—0.1 mg / mL) (Sigma-Aldrich, USA) eller phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA—0.8 µ; Sigma-Aldrich, USA). Ubehandlede prøver uten de testede ekstraktene ble evaluert som kontroller. Analysene ble kjørt i duplikater. Kjemiluminescens ble registrert kontinuerlig i 90 minutter ved 37 °C og ble uttrykt som relative lysenheter (RLU). Vi bestemte den totale MENGDEN ROS-produksjon fra det integrerte området under kjemiluminescenskurven.
monocyttaktiveringstest (MAT)
MAT ble utført i 10 × saltfortynnet heparinisert humant fullblod. Blodprøver ble samlet fra fem friske givere, samlet og fortynnet med saltvann. De fortynnede blodprøvene ble inkubert med sirkler med 6 mm diameter kuttet fra dressinger i sterile mikrotubes i 24 timer ved 37 °C. parallelt, lipopolysakkarid (lps, endelig c = 0. 25 IE/ mL; Endotoksin Standard E-Toksat; Sigma, USA) ble tilsatt Til den andre serien av prøver inkubert med bandasjeprøver for å stimulere en medfødt immunrespons mot bakterier. Blodceller sedimenterte under inkubasjonen, og etterlot en øvre fase av saltoppløsning-fortynnet plasma. Etter inkubasjon ble 200 µ av hver saltfortynnet plasmaprøve samlet og umiddelbart analysert i duplikater FOR IL-6 ved BRUK AV ET Il-6 Humant Ubestrøket ELISA-Sett i henhold til produsentens protokoll (ThermoFisher Scientific, USA). Absorbans ble lest ved Hjelp Av En EnSight Multimode Plateleser (PerkinElmer, USA) og den endelige IL-6 konsentrasjonen ble beregnet Av Kaleido Sw (Perkin Elmer, USA). De resterende plasma-og sedimenterte cellene ble lagret ved 4 °C for vurdering av hemolyse og toksisitet.
Hemolyse
Hemolyse ble påvist i gjenværende saltfortynnet plasma og sedimenterte celler FRA MAT. Etter sentrifugering ble 100 µ av hver prøve overført til en 96-brønns mikroplate og absorbans ble målt ved 550 nm. 1% Triton X-100 ble brukt som en positiv kontroll.
LDH-frigivelse
toksisiteten av sølvbandasjer til blodceller ble evaluert ved hjelp av laktatdehydrogenase (LDH) – analyse (Cytotoksisitetsdeteksjon KitPLUS, Roche, Sveits) i henhold til produsentens instruksjoner. To kilder til blodceller ble brukt-humant fullblod inkubert med sølvforbindinger som I MAT, og isolerte nøytrofiler. Absorbansen som ble brukt til bakgrunnskorrigering ble målt i tomme prøver uten LDH-reagenset. Resultatene rapporteres som absolutte verdier av optisk tetthet sammenlignet med en ubehandlet prøve.
Statistisk analyse
Hvis ikke annet er oppgitt, Ble Student t-test brukt til å evaluere statistisk signifikans av forskjeller mellom prøver og ubehandlede kontroller.