Innledning
Kcat Er omsetningsnummeret-antall substratmolekyl hvert enzymsted konverterer til produkt per tidsenhet. Hvis du kjenner konsentrasjonen av enzymsteder, kan Du passe Kcat i stedet for Vmax når du analyserer et substrat vs hastighetskurve.
modellen
Y = et*kcat*X/(Km + X)
X Er substratkonsentrasjonen.
Y er enzymhastighet.
kcat er omsetningsnummeret, antall ganger hvert enzymsted konverterer substrat til produkt per tidsenhet. Dette uttrykkes i den inverse av tidsenhetene Til y-aksen. For Eksempel, Hvis Y er i mikromol av substrat per minutt, så er kcat antall molekyler substrat produsert per katalytisk sted per minutt. Km Er Michaelis-Menten-konstanten, i de samme enhetene Som X. det er substratkonsentrasjonen som trengs for å oppnå en halv maksimal enzymhastighet.
Et er konsentrasjonen av enzymkatalytiske steder. Hvis enzymet har flere underenheter, merk at Et er konsentrasjonen av katalytiske steder, som kan være større enn konsentrasjonen av enzymmolekyler. Y-verdiene du angir er enzymhastighet angitt i konsentrasjonsenheter per tid. Et må oppgis i de samme konsentrasjonsenhetene (mens tidsenhetene er definert av kcat).
Vmax er maksimal enzymhastighet i De samme enhetene Som Y. det er ikke direkte vist i modellen ovenfor. Det er hastigheten til enzymet ekstrapolert til svært høye konsentrasjoner av substrat, så det er nesten alltid høyere enn noen hastighet målt i eksperimentet. Det beregnes ved å multiplisere et ganger kcat.
Forholdet til Michaelis-Menten-modellen
kurven vist ovenfor er identisk med kurven definert Av Michaelis-Menten-modellen. Du får identiske kurver når du passer enten modell til dine data, og identiske verdier For Km. Michaelis-Menten-modellen finner Vmax, som er den maksimale enzymhastigheten ekstrapolert ut til svært høye konsentrasjoner av substrat. Det uttrykkes i de samme enhetene du brukte til å skrive Inn y-verdiene dine (enzymaktivitet). Vanligvis er det greit å uttrykke dette (eller konvertere til ) mol/minutt / mg protein. Vmax bestemmes av hvor mange enzymsteder som finnes (Et) og hvor raskt enzymet kan konvertere substrat til produkt (kcat).
hvis du vet konsentrasjonen av enzymsider du har lagt til i analysen (Et), kan du passe den katalytiske konstanten Kcat ved hjelp av modellen ovenfor.
ved beregning Av Kcat avbryter konsentrasjonsenhetene, Så Kcat uttrykkes i enheter av invers tid. Det er omsetningsnummeret-antall substratmolekyl hvert enzymsted konverterer til produkt per tidsenhet.
Montering av Modellen med Prisme
1.Opprett EN xy-datatabell. Angi substratkonsentrasjon I X og enzymhastighet I Y. hvis du har flere eksperimentelle forhold, plasser den første i kolonne A, den andre i kolonne B, etc. Du kan også velge Prisms eksempeldata: Enzyme kinetics-Michaelis-Menten.
2.Når du har angitt data, klikker Du Analyser, velger ikke-lineær regresjon, velger panelet av enzymkinetikkligninger og velger Kcat.
3.Du ma begrense Et Til en konstant verdi, basert pa andre forsok. For å begrense verdien Av Et, gå til Begrens-fanen i dialogboksen ikke-lineær regresjon, sørg for at rullegardinmenyen ved Siden Av Et er satt til «Konstant lik» og skriv inn verdien. For eksempeldataene angir du 100 som verdien Av Et.
hvis du ikke vet verdien Av Et, kan du ikke passe kcat, men i stedet bør passe Vmax. Det er ikke mulig For Prism å passe både kcat og Et, da de to parametrene er sammenflettet, og en substrat-hastighetskurve gir ingen informasjon om deres individuelle verdier.
4.Med prøvedataene rapporterer Prism At Km= 5.886 med et 95% konfidensintervall fra 3.933 til 7.839. Best egnet verdi av kcat er 13,53 med et 95% konfidensintervall fra 11,97 til 15,09.
Merknader
•se listen over forutsetninger for alle analyser av enzymkinetikk.
•denne ligningen passer nøyaktig til samme kurve som ligningen som passer Vmax, i stedet For omsetningsnummeret Kcat. Produktet Av Kcat ganger Et (konsentrasjonen av enzymsteder) er Lik Vmax.
* denne ligningen er relatert til ligningen for allosteriske enzymer. Den allosteriske modellen legger til en ekstra parameter: Hill slope h. når h er lik 1,0, er de to modellene identiske.