det er ofte mye forvirring over betydningen av ‘enzymenheter’,’ enzymaktivitet ‘og’spesifikk enzymaktivitet’. Denne veiledningen forklarer disse nøkkelbegrepene på en enkel måte og diskuterer enzymanalysedesign og betydningen av å operere i det lineære området. Vi vurderer også standardkurver og om du skal plotte konsentrasjon eller absolutt mengde produkt på x-aksen. Noen tips om å sette opp analysekontroller og trekke fra emner diskuteres. Til slutt forklarer vi hvordan enzymaktivitetsverdier beregnes, og vi gir en enkel oversikt over kinetiske ligninger.
Definisjoner Av Enzymenheter
Enzymologi ville være mindre komplisert hvis alle brukte samme enhetsdefinisjon. En standard enhetsdefinisjon er gitt nedenfor:
1 enhet (U) er mengden enzym som katalyserer reaksjonen av 1 umol substrat per minutt (definisjon A).
i de Fleste R & d innstillinger, er 1 umol av substrat faktisk ganske mye materiale og andre definisjoner kan foretrekkes for å unngå å uttrykke mengder i fraksjoner av enheter. Følgende ikke-standarddefinisjon brukes ofte:
1 enhet (U) er mengden enzym som katalyserer reaksjonen av 1 nmol substrat per minutt (definisjon B).
Merk at endringen i definisjonen har en dyp effekt på det angitte antall enheter, dvs. 1 enhet enzym i henhold til definisjon A vil likestille til 1000 enheter i henhold til definisjon B!du kan også se enzymenheter uttrykt som milli-enhet (eller mU) som ganske enkelt betyr en tusendel av en enhet, uavhengig av hvordan enheten er definert.Klart den faktiske mengden av et enzym i et rør endres Ikke bare ved å endre enhetsdefinisjonen, men forsiktighet er nødvendig når man sammenligner aktivitetene til prøver fra forskjellige leverandører. Så lenge enhetsdefinisjonene er gitt, kan du omdanne det oppgitte antall enheter til nmol per min, noe som er entydig og tillater gyldige sammenligninger.
for klarhet i ditt eget arbeid kan du foretrekke å bruke ‘nmol per min’ (eller ‘umol per min’), men hvis konstant repetisjon er nødvendig så klart mye kortere sikt ‘enhet’ har sine attraksjoner.
Hva Er ‘Enzymaktivitet’
Aktivitet er sitert i enheter per ml (U/ml), med andre ord nmol per min per ml (hvis enhetsdefinisjon B er vedtatt). Dermed er aktivitetsverdier uttrykt i enheter også gjenstand for en illusorisk 1000-fold ‘økning’ hvis man bytter Fra enhetsdefinisjon A Til enhetsdefinisjon B. Igjen kan det ikke være noen forvirring hvis aktivitet uttrykkes i form av nmol per min per ml i stedet for enheter per ml.Siden aktivitet er relatert til konsentrasjon, følger det at to hetteglass med enzym kan inneholde samme antall enheter (totalt), men har forskjellige aktiviteter (konsentrasjoner).
Hva Er Spesifikk Enzymaktivitet?
Spesifikk enzymaktivitet (vanligvis bare angitt som ‘spesifikk aktivitet’) er antall enzymenheter per ml dividert med konsentrasjonen av protein i mg / ml. Spesifikke aktivitetsverdier oppgis derfor som enheter/mg eller nmol/min / mg (hvis enhetsdefinisjon B brukes).Spesifikk aktivitet Er et viktig mål på enzymets renhet og verdier for forskjellige grupper av et rent enzym bør være det samme, innenfor normal eksperimentell feil.Serielle fortynninger av en enzymoppløsning vil ha forskjellige enzymaktivitetsverdier, men identiske spesifikke aktivitetsverdier fordi ved beregning av spesifikk aktivitet påvirkes telleren (enheter/ml) og nevner (mg/ml) likt av prøvefortynning.
selv om spesifikk aktivitet er svært forskjellig fra aktivitet, er beregningen av spesifikk aktivitet likevel avhengig av aktivitetsverdien, og derfor vil den angitte spesifikke aktivitetsverdien også være avhengig av enzymenhetsdefinisjonen. Grupper som er under forventet spesifikk aktivitetsverdi kan inneholde urenheter eller enzymmolekyler som har blitt denaturert.
Faktorer Som Påvirker Enzymaktivitet
i denne delen diskuterer vi hvorfor et enzym kan ha forskjellige målte aktivitetsverdier i forskjellige laboratorier. Med dette mener vi reelle forskjeller i målt aktivitet, ikke åpenbare forskjeller forårsaket av bruk av ulike enhetsdefinisjoner.
forholdene under hvilke en analyse utføres vil påvirke de rapporterte aktivitetsverdiene. For eksempel utføres analyser vanligvis ved en temperatur mellom 20-37°C. Generelt sett vil et enzym være mer aktivt ved 37°C enn ved 20°C.
definisjonen av enzymenheten vil bli bedre uttrykt slik:
1 enhet (U) er mengden hvis enzym som katalyserer reaksjonen av 1 nmol substrat per minutt under standardbetingelser.
Dessverre er begrepet ‘standardbetingelser’ åpent for tolkning, og det kan være forskjellige brukerpreferanser, i Hvert Fall I r&d-miljøer. Dermed ti ulike forskningslaboratorier kan (ganske riktig) beregne ulike aktiviteter for samme løsning av enzym. De fleste forskningslaboratorier etablerer sine egne ‘standardbetingelser’ og kontrollerer hver ny batch internt. I kliniske settinger er standardbetingelser eksplisitt definert og alle laboratorier er pålagt å kjøre identiske analyser.
Utvikling Av Analyser og Betydningen Av Lineært Område
aktivitetsverdien (enheter/ml) for enzymet ditt er den viktigste parameteren når du utvikler en analyse. Dette skyldes at volumet (dvs. antall enheter) som du legger til, bestemmer mengden substrat som konverteres til produkt. Husk at 1 enhet katalyserer konverteringen av 1 nmol av substrat per min (definisjon B).
de rapporterte enhetene / ml kan gi deg en grov ide om hvor mye enzym du skal legge til, men da aktivitetsverdien kanskje ikke er bestemt i en test som er identisk med din, er det vanlig å forberede serielle fortynninger av enzymet (f.eks. Avhengig av analysesignalet (som vil være relatert til mengden substrat omdannet), kan det være nødvendig med et annet eksperiment for å komme inn på en egnet fortynning.
hva er den ‘beste’ fortynningen? For å svare på dette, må vi tenke på det viktigste aspektet av analysen design-lineær rekkevidde. Det er viktig for kvantitativt arbeid å operere i et område der et plott av analysesignal (ofte absorbans) versus enzymkonsentrasjon er lineær. De fleste analyser er lineære hvis graden av substratkonvertering er mindre enn 15%, forutsatt at det ikke finnes andre begrensende faktorer. 30 min) og temperatur (f. eks 25oC) graden av konvertering kan styres ganske enkelt ved å justere en parameter, dvs. antall enzymenheter tilsatt.
dette illustreres grafisk i Figur 1 med fortynninger uttrykt som gjensidige (dvs. fortynning av 1/10 = 0,1 på x-aksen). Din egen tomt kan variere i form og lineært område, men ved svært høy enzymkonsentrasjon utvilsomt vil analysesignalet ikke øke i forhold til mengden enzym tilsatt.analysen I Figur 1 er lineær opp til optisk tetthet (OD) 2,5 og en fortynningsfaktor på 0,02 (1/50 fortynning av enzym) ville være ideell for analysearbeid, da det gir et stort signal (~1,5) og ligger midt i det lineære området. Beregninger basert på resultater for fortynningsfaktorer i området mellom 0,04 og 0,12 (dvs. regionen med redusert helling) vil undervurdere det sanne nivået av enzymaktivitet fordi noe klart begrenser størrelsen på analysesignalet.
Mange faktorer kan operere for å begrense det lineære området, og området vil variere fra analyse til analyse. En vanlig årsak til ikke-linearitet er overdreven forbruk av substrat, noe som kan føre til at reaksjonshastigheten faller, men begrensninger av de optiske komponentene til plateleseren (eller hvilken måleenhet som brukes) kan også være signifikante. De fleste platelesere kan for eksempel ikke måle absorpsjonsverdier over 3 på en pålitelig måte, og denne begrensningen gjelder uavhengig av prosentandelen av substratet som er omgjort til produkt.
Fig 1. Absorbans Versus Mengde Enzym
selv om det ikke ellers diskuteres i denne veiledningen, bør man også være oppmerksom på at enzymer kan denaturere over tid, spesielt hvis de er svært fortynnede, og produktene av noen reaksjoner kan hemme enzymet. Faktisk er det andre mulige årsaker til ikke-lineær oppførsel, men det er vanligvis relativt enkelt å finne det lineære området ved prøving og feiling ved hjelp av serielle fortynninger av enzymet som beskrevet ovenfor.
Analysetid og Temperatur
disse parametrene kan også påvirke det lineære området da de påvirker frekvensen av substratkonvertering. For eksempel kan en analyse være lineær etter 15 min, men ved 60 minutter kan for mye substrat ha blitt konsumert. I denne situasjonen må du redusere mengden enzym for å kjøre analysen i 60 minutter. De samme hensyn gjelder for analyse temperatur som det kan også påvirke frekvensen av reaksjon.
De fleste vedtar en analysetid på et sted mellom 15 min og 60 min. 2 min) skal unngås fordi en liten forsinkelse i å stoppe reaksjonen vil føre til en betydelig feil i beregninger av aktivitet. Det er viktig å sikre at reagenser som er lagret i kjøleskap eller fryser, har likevekt til riktig temperatur før bruk, og dette er spesielt viktig hvis du har en relativt kort analysetid.
Analysevolum / Følsomhet
fra et praktisk perspektiv bestemmes/begrenses analysevolumet av forbruksvaren du bruker til analysene dine(f. eks. kyvetter, rør eller mikroplater). Signalet for de fleste enzymanalyser er proporsjonalt med analysevolumet, og forsøk på å miniatyrisere analysen (f. eks. for å spare reagenser) vil vanligvis føre til lavere signaler. Absorbansanalyser er imidlertid ofte et unntak, og en bytte fra en 3 ml kyvette til 1 ml mikrokuvette vil for eksempel ikke endre absorbansavlesningen hvis bredden (banelengden) på kyvetten fortsatt er 1 cm (dvs . lyset passerer fortsatt gjennom samme ‘lengde’ av væske). Dette skyldes at absorbansen er proporsjonal med banelengden, ikke til volumet av prøven.
i mikroplateabsorbansanalyser er banelengden lik væskens dybde, og det er mulig å miniatyrisere uten tap av signal ved å redusere diameteren til brønnene og opprettholde en konstant væskedybde. For eksempel kan 96 brønnplater lett imøtekomme 200ul prøve, men med et 50ul analysevolum ville det være bedre å bruke en 384-brønnplate for å øke banelengden over det som er sett med 50ul prøve i en 96-brønnplate.
Kontinuerlige Analyser (Måling Av Produktutseende over Tid)
de Fleste analyser utføres i en fast periode (endepunktanalyser) og reaksjonen stoppes ved tilsetning av et stoppreagensmiddel (f.eks. syre). I kontinuerlige analyser registreres imidlertid produktets utseende (mindre vanlig forbruk av substrat) kontinuerlig (f. eks. ved hjelp av en kartopptaker). De samme grunnleggende reglene gjelder; et plott av signal mot tid for en fast mengde enzym bør være lineær og hastigheten bør doble hvis mengden enzym dobles. Så lenge analysen drives i det lineære området, kan aktiviteten til passende fortynnede ‘ukjente’ bestemmes nøyaktig ut fra de opprinnelige reaksjonshastighetene målt med et sett med standarder.
Hvilken Substratkonsentrasjon Skal Jeg Bruke?
konsentrasjonen av substrat vil påvirke reaksjonshastigheten, men det er flere faktorer å vurdere ved valg av riktig konsentrasjon. Fra et praktisk synspunkt er en viktig vurdering mengden produkt som må genereres for å gi et målbart analysesignal. Siden frekvensen av en enzymreaksjon sannsynligvis vil falle når mer enn ca. 15% av substratet er hydrolysert, bør den opprinnelige konsentrasjonen av substrat generelt være minst 10x konsentrasjonen av produkt som er kjent for å gi et akseptabelt analysesignal.
En annen vurdering er Km for substratet. Mens du legger til mer substrat, betyr det generelt at du vil se høyere aktivitetsverdier, forholdet er ikke lineært, og kostnaden for substratet må kanskje vurderes. På dette punktet er det sannsynligvis nyttig å introdusere Den klassiske Michaelis-Menten-ligningen:
v = (Vmax S)/(Km + S) ……………. Eqn. (1)
hvor v er hastigheten, Vmax er maksimal mulig hastighet, S er substratkonsentrasjon og Km er lik substratkonsentrasjonen som gir halv maksimal aktivitet. Avledningen av denne ligningen og dens underliggende forutsetninger kan finnes i en hvilken som helst lærebok om enzymkinetikk. Selv om det er normalt å måle i stedet for å beregne frekvensen av enzymreaksjoner, er det nyttig å forstå de underliggende prinsippene for analysedesign.Michaelis-Menten-ligningen er nyttig ved at den hjelper deg med å velge en passende konsentrasjon av substrat hvis Km er kjent.
Når S=Km, v = (Vmax S)/2S, dvs. v / Vmax = S / 2S = ½.
med andre ord vil enzymet operere ved 50% av den maksimale mulige hastigheten Når S=Km.
ved å erstatte i ligning 1 verdiene For S = 10 Og Km = 1 vil du se at ved å øke substratkonsentrasjonen 10 ganger fungerer enzymet nå på ~90% av det maksimale mulige, i stedet for 50%. Klart dette er høyere, men ikke 10 ganger høyere.
Ved svært høye konsentrasjoner av substrat Blir Km i ligning 1 numerisk ubetydelig, og den målte hastigheten er da Lik Vmax.
mange analyser kjøres med substratkonsentrasjon ved eller rundt Km-verdien, men Hvis Km er veldig høy, kan det ikke være mulig å bruke en så høy konsentrasjon av substrat (f. eks. på grunn av kostnader eller begrenset oppløselighet).
i noen situasjoner kan det til og med være tilrådelig å bruke en relativt lav konsentrasjon av substrat. For eksempel, i farmasøytisk legemiddelfunn, vil bruken av svært høye substratkonsentrasjoner gjøre det vanskeligere å identifisere konkurrerende enzymhemmere (konkurrerende hemmere binder seg til samme sted som substratet).
en balanse mellom de ulike faktorene må treffes slik at analysen har et målbart signal, kan betjenes i det lineære området og kan oppfylle andre målmål (f. eks. kostnad, tid og så videre).
Standardkurver
en standardkurve er alltid nødvendig hvis du ønsker å beregne enzymaktivitet. Det er ikke viktig hvis du bare er interessert i relative aktivitetsverdier.
standardkurven er konstruert ved å måle analysesignalet med standardløsninger av reaksjonsproduktet over et passende konsentrasjonsområde. Ideelt sett bør du kjøre en standardkurve for hvert eksperiment, men hvis standardkurven er svært reproduserbar, kan det være akseptabelt å kjøre den med jevne mellomrom.
en typisk standardkurve er vist I Figur 2 nedenfor. DETTE er en standardkurve for En atpase-analyse, HVOR ATP hydrolyseres TIL ADP og Pi (uorganisk fosfat).
Fig 2. Standardkurve for Pi
fosfatet oppdages ved hjelp av et fargestoffbindende reagens som endrer farge i nærvær av fosfat. Spesifikasjonene til denne testen er imidlertid ikke viktige her; uansett produktets art eller deteksjonsmetoden som brukes, må en standardkurve som viser signalets avhengighet av mengden produkt i analysen, konstrueres. Kurven (ideelt sett er det en rett linje) brukes til å bestemme mengden produkt som genereres i prøver med ukjent aktivitet, dvs. fra absorbansverdien, ved å lese av avskjæringen på x-aksen. (De fleste grafiske programvarepakker vil automatisk beregne verdier av x fra målte verdier av y). Mengden aktivitet kan da beregnes (se senere).
Plotter Jeg Konsentrasjon eller Absolutt Mengde På X-Aksen?
det er ikke noe enkelt korrekt svar her, og muligheten for å bruke begge tilnærmingene kan ofte føre til forvirring når aktivitetsverdier beregnes. For eksempel er plotting av nmol av produkt på x-aksen veldig praktisk hvis du trenger å beregne aktivitetsverdier(husk, aktivitet = nmol per min per ml). Laboratoriereagenser fremstilles imidlertid vanligvis ved kjente konsentrasjoner, og det er ofte lettere å plotte disse verdiene på x-aksen. Men når du beregner aktiviteten (eller spesifikk aktivitet) av enzymet ditt, må du huske å konvertere konsentrasjonen på x-aksen til antall nmoler av produkt dannet, noe som betyr at du må ta hensyn til analysevolumet. Årsaken er lett å forstå: 50ul og 100ul volumer av en standardløsning vil være i samme konsentrasjon, men større volum vil inneholde dobbelt så mye produkt. Vanligvis er det best å velge en tilnærming (dvs. enten plotte absolutt mengde produkt eller konsentrasjon) slik at samme metode som beregner aktivitet alltid brukes.
Kontroller og Subtraksjon av ‘Tomme’ Data
Riktige kontroller er avgjørende for kvantitativt arbeid, som er riktig bruk av kontrolldataene i beregninger.
Kontroller forteller deg (indirekte) hvor mye av analysesignalet skyldes enzymets virkning og hvor mye som oppstår av andre grunner. En vanlig kilde til ‘falske’ signal er substratet (som ofte kan være forurenset med produktet). Andre analysekomponenter kan også gi et lite signal avhengig av komponentens natur og typen av analyse. Formålet med kontrollene er å tillate deg å fjerne (ved subtraksjon) noen elementer av det totale signalet som ikke er relatert til enzymets virkning. Hvis analysen er godt utformet og analysereagensene er av god kvalitet, er behandlingen av kontroller vanligvis ganske enkel.
noen generelle retningslinjer er gitt nedenfor:
hvis vi går tilbake Til kolorimetrisk analyse for å oppdage uorganisk fosfat, kan vi markere noen potensielle problemer som lett oppdages med riktige kontroller.0,08 i en 96-brønnplate ved bølgelengden som brukes til måling (rundt 650nm).
Vi kan sette opp følgende analyser/kontroller (avlesninger i parentes i en hypotetisk analysesituasjon):
- alle analysekomponenter minus enzym (0.5)
- Enzym på egen hånd (0.1)
- Enzym pluss alle andre komponenter (1.8)
klart analysesignalet på 1.8 skyldes Ikke utelukkende enzymets virkning på substratet.
for enhver enzymanalyse er en nøkkelkontroll (A) å utelate enzymet (og erstatte med buffer). Dette vil gi deg bakgrunnssignalet for alle de andre analysekomponentene som en gruppe, inkludert substratet som kan inneholde en liten mengde produkt. Denne kontrollen forteller deg ikke bakgrunnssignalet for enzymet, men klart kan du ikke legge enzymet til substratet som en kontroll! I de fleste analyser gir enzymet ikke noe signal fordi det fortynnes betydelig før bruk i analysen. Dette kan enkelt kontrolleres, som I B ovenfor.
dataene For prøve A (ovenfor) antyder at blandingen er forurenset med uorganisk fosfat. De enkelte komponentene kan deretter kontrolleres for å identifisere kilden til problemet. Denne situasjonen er ganske vanlig for analyser Av Atpaser og andre fosfatgenererende enzymer, da substratene ofte er ustabile og delvis hydrolyseres for å gi noe uorganisk fosfat.Det kan være vanskelig å korrigere rådata hvis flere komponenter gir falske signaler; eliminering av problemet ved kilden er generelt langt bedre enn noen matematisk behandling. Den korrigerte verdien for prøve C ovenfor kan synes å være 1,2 (dvs .1.8 – 0.5 – 0.1) men strengt tatt er dette feil. Husk at analyseplaten pluss deteksjonsreagensen gir et bakgrunnssignal på rundt 0,08, så kilden til det meste av signalet for kontroll A er plasten på platen og / eller deteksjonsreagensen. Det samme lille signalet må også være skjult i verdien for enzymkontrollen. Således i korreksjonen som er brukt ovenfor, har vi trukket dette skjulte blanke to ganger.
du må alltid trekke kontroller fra analysedata, og det er å foretrekke å kombinere alle stoffer (unntatt enzym) og trekke en enkelt verdi. Hvis denne tilnærmingen er tatt, behandles standardkurven på samme måte og en kontrollverdi trekkes fra (dvs. verdien oppnådd i fravær av produkt, dvs. analog med platen / reagensemnet diskutert ovenfor). Dermed inneholder verken de subtraherte analysedataene eller den subtraherte standardkurven det potensielt misvisende bakgrunnssignalet forårsaket av plate – /analysereagensen.til Slutt, som vi har sett, blir falske signaler lett oppdaget med riktige kontroller, men den beste strategien for å få data av god kvalitet er å bruke reagenser med lav bakgrunn slik at kontrollverdiene er lave. Det er også nyttig å generere et analysesignal (på grunn av enzym) som er langt høyere enn noe bakgrunnssignal. Ideelt sett bør signal-til-bakgrunn-forholdet være minst 5 og helst 10 eller mer for nøyaktig kvantitativt arbeid.
Beregning Av Aktivitetsverdier
Dette er ganske lett å forstå hvis vi back-beregne fra rå analysedata i trinnvis måte. For eksempel, la oss si at vi har generert 10nmol av produkt i vår enzymreaksjon (dvs. bestemt fra standardkurven til signal versus absolutt mengde produkt). Siden aktivitet uttrykkes som nmol per min per ml, må vi vurdere tid og volum og, kanskje mindre åpenbart, mengden og fortynningen av enzym for å beregne aktivitet.
hvis analysen er 10 min lang, er antall nmol per min i eksemplet ovenfor 1. (trinn 1)
hvis analysevolumet er 200ul, må vi multiplisere med 5 (dvs. 1000/200) for å få nmol per min per ml. (trinn 2)
denne verdien gjelder aktiviteten til enzymet i analysen, ikke i prøven av enzymet som brukes til å sette opp analysen. Noen ytterligere korrigeringsfaktorer er nødvendig for å bestemme enzymaktiviteten i den opprinnelige prøven av enzym.
enzymet kan ha blitt fortynnet før bruk, og det må fortynnes ytterligere av de andre komponentene som er tilstede i analysen. Hvis analysen (200ul totalt) består av 20ul enzym, og enzymet er forfortynnet 1/100 før 20ul-prøven er tilsatt, kan du sannsynligvis se at vi skal multiplisere først med 10 (trinn 3) og deretter med 100 (trinn 4) for å få aktiviteten til enzymet i den opprinnelige enzymoppløsningen.
Så langt er dette relativt greit. Imidlertid nevnte vi tidligere at konsentrasjonen ofte er plottet på x-aksen til standardkurven. Dermed kan verdiene uttrykkes i mM-termer (ikke mmol), og du kan ikke bestemme antall mmol bare ved å inspisere standardkurven.
siden mM betyr mmoles per liter, har vi en avvik mellom det underforståtte volumet PÅ 1L og det faktiske analysevolumet. Således hvis vi har 10mM produkt og analysevolumet er 200ul, må vi dele med 5000 for å få antall mmoles av produktet.
du kan merke her at deling med 5000 her kompenserer noen av multiplikasjonsoperasjonene som var påkrevd ovenfor. Faktisk er det ganske normalt for korreksjonsfaktorer å avbryte. For eksempel, i en 10 minutters analyse med 1/10 fortynnet enzym, vil du dele med 10 for å få nmol per minutt og multiplisere med 10 senere for å korrigere for fortynningsfaktoren.
det følger at hvis du alltid bruker standard analyseforhold (dvs. din standard), vil du kunne multiplisere x-verdien fra standardkurven med en enkelt global korreksjonsfaktor, som omfatter alle de andre individuelle korreksjonsfaktorene, for å beregne aktivitetsverdiene dine. Bare ved første anledning må du identifisere de enkelte korreksjonsfaktorene.
Enzymhemming / Medikamentscreening
dette er et enzymområde hvor det fortsatt er behov for å operere i det lineære området, men hvor beregninger av aktivitetsverdier vanligvis ikke er relevante; snarere er den relative reaksjonshastigheten (eller relativ mengde produkt dannet) i nærvær og fravær av et teststoff nøkkelen, noe som krever lite mer enn enkle beregninger ved hjelp av de tomme subtraherte analysedataene. Etter subtraksjon av blankene uttrykkes mengden av produkt som en prosentandel av mengden oppnådd i fravær av teststoffet(dvs. 100%). Disse analysene kan noen ganger kjøres med ganske lave signal-til-bakgrunnsforhold, fordi spørsmålet blir spurt – hemmer teststoffet reaksjonen –
– krever bare et ja / nei svar.
Sammendrag
denne veiledningen har forhåpentligvis gitt klare forklaringer på ‘enzymenheter’,’ enzymaktivitet ‘og’ spesifikk enzymaktivitet’, og enhetsdefinisjoner og betydningen av det lineære området. Detaljene i hva du skal plotte på x-aksen av standard kurver er et spørsmål om brukerens preferanser, men noen omsorg er nødvendig når aktiviteter beregnes. Analysekontroller er viktige, men bruk av reagenser av høy kvalitet er bedre enn å fjerne bakgrunner ved hjelp av matematiske tilnærminger. Et høyt signal til bakgrunnsforhold er ønskelig for kvantitativt arbeid, og en rekke parametere kan varieres for å øke analysesignalet; det er ikke alltid nødvendig bare å legge til mer enzym. Enzymaktivitetsverdier kan enkelt beregnes hvis en trinnvis tilnærming brukes til å identifisere nøkkelanalysevariablene.
Se Flere Protokoller og Veiledninger