din rådgiver forteller deg at han vil at du skal bruke HPLC til å analysere forbindelsen din. Du vet at du har hørt om denne teknikken før, men du kan ikke huske HVA HPLC står for, enn si hvordan du skal gjøre det! Vi har alle vært der, og jeg vedder på at du skulle ønske du hadde betalt mer oppmerksomhet i det foredraget!
Frykt ikke-I denne serien av artikler vil jeg minne deg om kraften I hplc-kolonnen 🙂
i denne første artikkelen vil jeg ta deg gjennom prinsippet bak HPLC og minne deg om bruken – du vil være klar for laboratoriet på kort tid!
HVORDAN FUNGERER HPLC?
høyytelses væskekromatografi, ELLER HPLC, er et langt navn for en kraftig teknikk basert på det enkle faktum at individuelle forbindelser oppfører seg annerledes i vann.
HPLC separerer og renser forbindelser i henhold til deres polaritet, eller deres tendens til å like eller misliker vann. For å sette polaritet i sammenheng, vurder at olje er en apolar væske som ikke blandes med vann. Etanol, derimot, er polar og som mange av dere vet, blander veldig bra med vann (Vodka og cola noen??).
jeg har forsøkt å forenkle hele prosessen I Figur 1 nedenfor, men først la oss se på hovedkomponentene som er involvert I HPLC. Beklager på forhånd for noen uunngåelig sjargong!
komponentene
hplc-kolonnen
dette er også kjent som den stasjonære fasen. Dette er arbeidshesten TIL hplc-maskinen, er laget av en av en rekke stoffer (ofte silika) og er svært kompakt i naturen. Silisiumpartiklene er funksjonalisert av lange karbonkjeder. Karbonkjedene er apolare og derfor jo lengre kjeden, jo mer apolar blir kolonnen. Kolonner som inneholder 18-karbonkjeder brukes ofte Og er kjent Som C18 kolonner.
hplc-prøven
Prøvetyper varierer sterkt avhengig av feltet og typen av forbindelser i spørsmålet. HPLC kan brukes til å analysere forbindelser i biologiske prøver (urin, blod, spytt og muskel), miljøprøver, medisinsk kjemi (narkotika) og mikrobiologi (toksiner produsert av sopp og bakterier).
injeksjon av prøve
Prøver injiseres i hplc-kolonnen. Dette pleide å bli utført manuelt, noe som betyr at noen stakkars sjel måtte sitte ved hplc-maskinen i timevis og injisere hver prøve med en sprøyte, noen ganger hele natten!Heldigvis har nyere modeller en automatisk injektor, noe som reduserer manuell inngang og gir høyere gjennomstrømning. Moderne maskiner er utstyrt med programvare slik at brukeren kan legge inn en liste over prøver, hvor mye og i hvilken rekkefølge de skal injiseres. Så du kan nyte lunsj mens HPLC kjører selv!
mobilfasen
dette er egentlig bare en blanding av vann og et organisk løsningsmiddel (vanligvis acetonitril eller metanol). Mobilfasen får navnet fordi den beveger seg gjennom kolonnen og samtidig eluerer (eller spyler ut) forbindelsene fra kolonnen.
Forbindelser elueres ofte langs en konsentrasjonsgradient. Hvis du er noe som meg, konsentrasjon og gradient er to ord du hater å se kommer sammen i en setning! Det betyr bare at prosentandelen vann i mobilfasen avtar over tid, mens prosentandelen av det apolare løsningsmidlet øker samtidig. Dette betyr at mobilfasen gradvis blir mer apolar. Ikke bekymre deg for mye om gradienter for nå, da de vil vises igjen i en oppfølgingsartikkel.
hplc run
HPLC kan utføres i en rekke moduser. Den mest brukte metoden er kjent som reversert fase (rp-HPLC), og dette er hva jeg beskriver her. I denne modusen separeres forbindelser som starter med de mest polare, og slutter med apolare forbindelser. For alle moduser flytter en kraftig pumpe prøven og mobilfasen gjennom kolonnen. En typisk løp kan ta mellom 10-60 minutter.
prinsippet bak HPLC-en nærmere titt
Nå som du har en ide om komponentene som er involvert, la oss gå videre til prinsippet litt mer detaljert.
jeg nevnte ovenfor AT HPLC separerer forbindelser på grunnlag av polaritet. Men hvordan fungerer dette egentlig? Engelsk vær så snill! Som gradient spark i, løsemiddel konsentrasjonen øker mens vannkonsentrasjonen avtar. Dette gjør mobilfasen mer og mer apolar. Forbindelser inneholdt i prøven vil holde seg til karbonkjedene i kolonnen, med de mest apolare forbindelsene som stikker sterkest, og de mest polare forbindelsene stikker svakt.
Figur 1 viser hva som skjer med en prøve som inneholder en blanding av forbindelser etter injeksjon i kolonnen. Forbindelsene binder seg til kolonnen og spyles ut på forskjellige tidspunkter, avhengig av om de er mer sannsynlig å holde seg til kolonnen eller mobilfasen når den pumpes gjennom. Tiden som hver forbindelse eluerer (eller spyler ut) fra kolonnen er kjent som forbindelsens retensjonstid (Rf).
Figur 1: prinsippet bak HPLC
Figur 1: Forbindelser med forskjellige polariteter (angitt som mørkere nyanser av blått) injiseres i hplc-kolonnen (hele sylinderen). Mobilfasen pumpes gjennom kolonnen, og tilsetning av løsningsmiddel langs en konsentrasjonsgradient (vist som en svart prikket linje) reduserer kontinuerlig den totale polariteten til mobilfasen (Y-aksen). Forbindelser kan holde seg til enten kolonnen eller mobilfasen, avhengig av hvor polar de er. Forbindelser vil til slutt holde seg til mobilfasen når deres polaritet samsvarer med mobilfasen. De vil da dissociere fra kolonnen og vil bli eluert på et bestemt tidspunkt (X-akse) under løp. Denne gangen er Kjent Som Rf for den forbindelsen.
Forstå utgangen
utgangen eller resultatene av EN HPLC-løp er vanligvis sett på som et kromatogram (Figur 2). Dette er en horisontal serie topper som representerer forbindelser eluert fra kolonnen med forskjellige Rf-verdier. Moderne HPLC-utstyr er ofte koblet til en DIODE array detektor (DAD), slik at brukeren kan se på det resulterende kromatogrammet av separerte forbindelser i bølgelengder fra 190 nm til 900 nm. Hvis forbindelsene som undersøkes er kjent, kan brukeren velge å se bare på 1 eller noen få utvalgte bølgelengder. For eksempel kan kokain observeres ved 254 nm.
Figur 2: et typisk hplc-kromatogram
Figur 2: dette kromatogrammet viser separasjonen av forbindelser fra en kjemisk reaksjon, og kromatogrammet vises ved 254 nm. To hovedtopper oppstår på 8, 20 og 9 minutter, som representerer to forbindelser med disse retensjonstidene. Antall absorbansenheter (AU) vises På Y-aksen mens tiden for kjøringen vises På X-aksen.
Anvendelser
INNENFOR biologi og medisin brukes HPLC ofte som et analytisk verktøy for å analysere biologiske og miljømessige prøver for tilstedeværelse eller fravær av kjente forbindelser (for eksempel metabolitter, legemidler, toksiner, plantevernmidler), og kan bistå i identifisering av ukjente forbindelser.innenfor kjemi brukes IMIDLERTID hplc rutinemessig til å overvåke kjemiske reaksjoner, samt å bestemme renheten av produktene. I tillegg kan PROSESSEN MED HPLC modifiseres til preparativ HPLC, hvorved forbindelser av interesse kan renses for videre bruk.
HPLC kan komme over som svært komplisert til å begynne med, men vær trygg, akkurat som de fleste andre labteknikker, gir DET mye mer mening når du faktisk gjør det.Hold deg oppdatert på mine oppfølgingsartikler i de kommende ukene, der jeg vil gå gjennom noen tips om hvordan du kan få det beste UT AV DIN hplc-løp, avhengig av ditt forskningsmål, samt diskutere objektivt hvordan HPLC kan brukes i din forskning.
er det noen andre aspekter av denne teknikken du vil ha dekket mer detaljert? I så fall vil vi gjerne høre fra deg!
Glad HPLC-ing 🙂
har dette hjulpet deg? Vennligst del med nettverket ditt.