på 1970-tallet ble det meste av væskekromatografi utført ved hjelp av en fast støttestasjonær fase (også kalt en kolonne) som inneholdt umodifiserte silika eller aluminaharpikser. Denne typen teknikk er nå referert til som normalfasekromatografi. Siden den stasjonære fasen er hydrofil i denne teknikken, vil molekyler med hydrofile egenskaper inneholdt i mobilfasen ha en høy affinitet for den stasjonære fasen, og vil derfor adsorbere til kolonnepakningen. Hydrofobe molekyler opplever mindre affinitet for kolonnepakningen,og vil passere gjennom for å bli eluert og oppdaget først. Eluering av de hydrofile molekylene adsorbert til kolonnepakningen krever bruk av mer hydrofile eller flere polare løsningsmidler i mobilfasen for å skifte fordelingen av partiklene i den stasjonære fasen mot den mobile fasen. Omvendt fasekromatografi Er en teknikk som bruker alkylkjeder kovalent bundet til de stasjonære fasepartiklene for å skape en hydrofob stasjonær fase, som har en sterkere affinitet for hydrofobe eller mindre polare forbindelser. Bruken av en hydrofob stasjonær fase er i hovedsak omvendt av normal fasekromatografi, siden polariteten til de mobile og stasjonære faser har blitt invertert-derav begrepet reversert fasekromatografi. Omvendt-fase kromatografi benytter en polar (vandig) mobil fase. Som et resultat har hydrofobe molekyler i den polare mobilfasen en tendens til å adsorbere til den hydrofobe stasjonære fasen, og hydrofile molekyler i mobilfasen vil passere gjennom kolonnen og elueres først. Hydrofobe molekyler kan elueres fra kolonnen ved å redusere polariteten til mobilfasen ved hjelp av et organisk (ikke-polar) løsningsmiddel, noe som reduserer hydrofobe interaksjoner. Jo mer hydrofob molekylet er, desto sterkere vil det binde seg til den stasjonære fasen, og jo høyere konsentrasjon av organisk løsningsmiddel som vil bli nødvendig for å eluere molekylet.Mange av de matematiske og eksperimentelle betraktningene som brukes i andre kromatografiske metoder, gjelder OGSÅ FOR RPC (for eksempel er separasjonsoppløsningen avhengig av lengden på kolonnen). Den kan brukes til separasjon av et bredt utvalg av molekyler. Det brukes vanligvis ikke til separasjon av proteiner, fordi de organiske løsningsmidlene som brukes i RPC, kan denaturere mange proteiner. Av denne grunn er normal fasekromatografi mer vanlig brukt til separasjon av proteiner. Imidlertid kan denatureringen av proteiner faktisk være gunstig i den senere analysen av prøvene oppnådd fra kromatografien. Hvis en enzymatisk fordøyelse med trypsin utføres på de analyserte proteinene, er linearisert protein mer egnet for dette. Derfor kan denatureringen av proteiner ved hjelp av passende løsningsmidler som forårsaker utfoldelsen av proteinene, faktisk være forsettlig før du tar den fraksjonerte prøven gjennom massespektrometri.
I Dag ER RPC en ofte brukt analytisk teknikk. Det finnes en rekke stasjonære faser tilgjengelig for BRUK I RPC, noe som gir stor fleksibilitet i utviklingen av separasjonsmetoder.
silikabaserte stasjonære faserrediger
enhver inert polar substans som oppnår tilstrekkelig pakking kan brukes til omvendt fasekromatografi. Den mest populære kolonnen er en oktadecyl karbonkjede (C18)-bundet silika (USP klassifisering L1). Dette etterfølges Av C8-bundet silika (L7), ren silika (L3), cyan-bundet silika (L10) og fenyl-bundet silika (L11). Merk At C18, C8 og fenyl er dedikert reversert fase harpiks, mens cyano kolonner kan brukes i en reversert fase modus avhengig av analytt og mobil fase forhold. Ikke Alle c18-kolonner har identiske retensjonsegenskaper. Overflatefunksjonalisering av silika kan utføres i en monomer eller en polymerreaksjon med forskjellige kortkjedede organosilaner som brukes i et andre trinn for å dekke gjenværende silanolgrupper (endekapping). Mens den generelle retensjonsmekanismen forblir den samme, vil subtile forskjeller i overflatekjemikaliene i forskjellige stasjonære faser føre til endringer i selektivitet.
Moderne kolonner har forskjellig polaritet. PFP er pentafluorfenyl. CN er cyano. NH2 er amino. ODS er oktadecyl Eller C18. ODCN ER en blandet modus kolonne bestående Av C18 og nitril. SCX er sterk kationisk utveksling (brukes til separasjon av organiske aminer). SAX er sterk anionisk utveksling(brukes til separasjon av karboksylsyreforbindelser).