ankomsten av aerob biologi ble varslet om to milliarder år siden, da primitive cyanobakterier utviklet evnen til å photooxidize vann. Oksygen ble frigjort som et avfallsprodukt, og atmosfæriske o2 nivåer steg raskt. Denne raske endringen til en oksygenatmosfære introduserte et ødeleggende forurensende stoff, men til slutt utviklet organismer seg som kapitaliserte på den sterke drivkraften For o2-reduksjon. Enzymaktive steder som var i stand til å binde og aktivere oksygen utviklet seg, og nye klasser av biokjemi som bruker O2 som en termodynamisk vask for å drive ellers ugunstige reaksjoner ble mulig. Effektiviteten av matmetabolismen endret seg dramatisk. MENGDEN ATP som kunne produseres ved å metabolisere glukose aerobt, for eksempel, økte nesten 20 ganger. Eukaryoter dukket opp kort tid etter oksygenatmosfæren og ble til slutt etterfulgt av det mangfoldige utvalg av multicellulære organismer som eksisterer i dag. I vår aerobe biokjemi brukes O2 i en mengde syntetiske reaksjoner som er grunnleggende for nesten alle aspekter av cellevekst, utvikling og reproduksjon.
Til Tross for sin biokjemiske allsidighet brukes imidlertid >95% av oksygenet vi bruker, i respirasjon. Høy-energi elektroner avledet fra mat traversere mitokondrie elektron transportkjeden i en serie av exergonic redoksreaksjoner. Disse energisk nedoverbakke elektronoverføringene brukes til å utvikle den kjemisosmotiske protongradienten som til slutt produserer ATP. Oksygen er den endelige elektronacceptoren i denne respiratoriske kaskaden, og reduksjonen til vann brukes som et kjøretøy for å fjerne mitokondriellkjeden av lav-energi, brukte elektroner. Enzymet som katalyserer denne prosessen, cytokrom oksidase, spenner over mitokondriamembranen. Det binder, aktiverer og reduserer Opptil 250 molekyler O2 per sekund og parrer energien som frigjøres i denne prosessen til translokasjonen av protoner som bidrar til den kjemiosmotiske gradienten. Mekanismen som cytokrom oksidase katalyserer denne bemerkelsesverdige kjemi har blitt studert intenst. Resultatene rapportert I denne utgaven Av Fabian, Wong, Gennis og Palmer gir ny innsikt i denne prosessen og støtter den voksende oppfatningen om at samlende konsepter eksisterer for måten oksygenutnyttende enzymer aktiverer O2 For O⩵O bindingsspaltning og reduksjon (1).
reduksjonen Av O2 i cytokrom oksidase skjer under alvorlige begrensninger. Prosessen foregår med lite overpotensial, frigjøringen av delvis reduserte giftige oksygenmellomprodukter fra det aktive stedet minimeres, og den frie energien som er tilgjengelig I o2-reduksjon, er kombinert med høy effektivitet til protontranslokasjon (2, 3). Enzymet opererer under disse begrensningene ved å bruke en heme Fe, kalt heme a3, og en kobberion, betegnet CuB, i et binukleært senter Hvor O2 binder og reduseres (Se Fig. Fig.1).1). Elektron inngang til dette området skjer fra cytokrom c ved hjelp av en andre heme jern, heme a, og en andre kobber senter, CuA. Nylig ga Yoshikawas gruppe (4) og Michels gruppe (5) uavhengig og samtidig krystallstrukturer av enzymet som har gitt dyp innsikt i mange aspekter av den katalytiske syklusen, spesielt hvordan protoner og oksygen sannsynligvis vil bevege seg gjennom proteinet. Mekanismen For o2 reduksjon av oksidase har blitt forfulgt av en rekke grupper med en rekke spektroskopiske teknikker (for vurderinger, se refs. 6 og 7). Fra dette arbeidet kan en forenklet reaksjonssekvens som involverer forbigående, men detekterbare mellomprodukter ved det binukleære senteret skrives som følger (Se Også Fig. Fig.2):2):
p-og F-artene har spesielt tiltrukket seg oppmerksomhet, da De har vært involvert i pumpemekanismen som driver protontranslokasjon (8). Nylige arbeider Fra Michel (9) og Fra Wikströ og kollegaer (10) har fremhevet både fremdriften og usikkerhetene i vår forståelse av mekanismen som par eksergonisk elektron overfører til oksygen med endergonisk protonbevegelse over membranen.
det binukleære senteret i cytokrom oksidase. Heme a3 og CuB er vist sammen med den proksimale ligand for heme jern, H376, Og CuB ligand, H240, som er kryssbundet Til Y244 (24, 25). O2 binding og reduksjon forekommer i området mellom a3 jern og CuB.
et forenklet skjema for reaksjonen mellom cytokrom oksidase og O2. Binuclear-området, som inneholder heme a3, CuB og den tverrbundne h240-Y244 (H-Y) – strukturen, er vist. Reduksjon og protonering av oksidert form av senteret produserer det reduserte stedet. Dette binder O2 til å danne først oksyartene, som reagerer videre for å produsere P – og F-mellomprodukter, før regenereringen av oksidert form av enzymet. Reduksjonen Av P Og F er begrenset av protonoverføringsreaksjoner, som angitt. Trinnene Mellom P og den reduserte formen på stedet har vært involvert i protonpumpeprosesser, som er indikert med røde piler. Støkiometri av disse trinnene er et spørsmål om nåværende undersøkelse, selv om opptil fire protoner kan pumpes i løpet av hele syklusen.Et vedvarende problem med å rakne oksygenkjemien ved det binukleære senteret i cytokrom oksidase og dets kobling til protonpumpen er å etablere de molekylære strukturer av mellomprodukter i skjemaet ovenfor. Det er enighet om At mellomprodukt For F innebærer en mellomprodukt for ferryl-oxo ved heme a3, a34+⩵(3, 6, 11, 12), Men strukturen I P har vært et spørsmål om betydelig kontrovers. De første oppdragene til denne arten postulerte at den inneholdt en binding intakt, a33 + – O2⩵ art, derav betegnelsen P for «peroksy» (f. eks. 3, 8 og 13). Weng og Baker tolket imidlertid sine optiske data for å indikere At O⩵o bindingsspaltning allerede hadde skjedd ved P, og at denne arten også hadde en a34+⩵o-struktur ved det binukleære senteret (14). Denne konklusjonen ble senere støttet av flere spektroskopiske undersøkelser (15-17). Kitagawa, Proshlyakov og deres kolleger lyktes i Å bruke Raman-spektroskopi for å oppdage a34 + ⩵o strekkbevegelse (18, 19) i En Form For P generert ved å tilsette peroksid til det oksiderte enzymet. Etterfølgende arbeid viste at den samme vibrasjonen kunne observeres når oksygen tilsettes til en to-elektron redusert form av enzymet, og bekrefter at oksygenkjemi og peroksidkjemi i oksidase går gjennom vanlige mellomprodukter (20). Videre viste tiden for Utseendet Til P i dette arbeidet at denne arten er kinetisk kompetent(se også refs. 21 og 22). Således, fra det spektroskopiske arbeidet, og fra nyere beregningsarbeid også (23), er den fremvoksende oppfatningen At P faktisk er En O⩵O bond-spaltet art.
arbeidet rapportert Av Fabian et al. (1) gir nye, uavhengige og overbevisende bevis på At O⩵o-bindingen spaltes i cytokrom oksidase På p-nivå. I sine eksperimenter, de begrunnet at verken oksygenatom i en binding-intakt peroksystruktur er sannsynlig å utveksle med løsemiddel vann. Hvis P forekommer som a34+⩵o-arten, forventer man imidlertid at det andre oksygenatomet sannsynligvis er på nivået av hydroksid eller vann, og at dette oksygenet godt kan bytte med vann i den vandige bufferen. Ved Å bruke 18O2 som substrat i en vandig buffer som inneholdt H216O, fanget De P-mellomproduktet og analysert for utseendet AV H218O. Deres massespektrometriske resultater viser tydelig at et enkelt oksygenatom FRA 18o2-substratet kan byttes ut med løsningsmiddelvann, i utmerket avtale med analysen ovenfor og tildelingen Av P som en bond-spaltet ferryl-oxo-art.
erkjennelsen av At P har en a34+⩵o struktur har en rekke viktige implikasjoner. Transformasjonen av bundet O2 i oksyartene til hydroksid (eller vann) og en ferrylokso I P krever totalt fire elektroner. Bare tre er imidlertid lett tilgjengelige i binuclear center-to fra heme a3 som det går fra +2 til + 4 valens tilstand og en fra CuB som den oksyderes fra cuprous til cupric. Kilden til den fjerde elektronen er uklar. Oksidasjon av heme-makrocyklusen, som forekommer I Forbindelser I i noen peroksidaser, kan elimineres på Grunnlag Av Raman og optiske data (6, 7), Og Cu3+ har ikke blitt påvist i biologisk miljø. Den mest sannsynlige kandidaten er da en redoksaktiv proteinsidekjede, som forekommer i cytokrom c-peroksidase, hvor tryptofan er redoksaktiv, eller i prostaglandinsyntase, som inneholder en oksiderbar tyrosinrest (24). Yoshikawa og kollegaer (25) ga slående krystallografisk bevis som sterkt støtter forekomsten av en redoksaktiv sidekjede. De viste At Y244 i binuclear center er tverrbundet til En Av CuB ligandene, H240, og at fenolhodegruppen er orientert slik at-OH-gruppen peker direkte inn I O2-bindende hulrom (Fig. (Fig.1).1). Michel har rapportert lignende krystallografiske data (26), Og Buse og kollegaer har nylig rapportert biokjemiske data som støtter forekomsten Av H240-Y244 krysslink (27). Nylige EPR-data har også blitt rapportert som indikerer tilstedeværelsen av tyrosylradikaler når peroksid tilsettes til hvilende enzym, selv om den spesifikke sidekjeden (e) som er involvert ikke er identifisert (28, 29). Samlet sett tyder disse resultatene sterkt på at tverrbundet tyrosin er kilden til den fjerde elektronen i aktivering og reduksjon Av o2 ved cytokrom oksidase. Denne formodningen forer til den forenklede reaksjonssyklusen I Fig. Fig.2,2, hvor den tverrbundne H – y-strukturen er vist eksplisitt og foreslått å bli oksidert til det nøytrale tyrosylradikalet I p-mellomproduktet.
ordningen I Fig. Fig.22 fremhever analogiene mellom cytokrom oksidase og peroxidaser og katalaser i form av oksygen–oksygenbinding spaltningskjemi og i form av produktene som følge av reaksjonen. I oksidase trekker enzymet ut tre elektroner fra metaller i det aktive området og et fjerde elektron fra en organisk del for å redusere O2 i ett trinn Til o⩵ og OH -. Begge disse produktene er på vannnivå, selv om ytterligere protonasjon og frigjøring bare forekommer i senere trinn av reaksjonen. I peroksidaser og katalaser trekker enzymet ut ett elektron fra et metall på det aktive stedet og et andre elektron fra en organisk del for å redusere H2O2 i ett trinn Til o⩵ og OH -. I peroksidaser og katalaser er Det umiddelbare produktet av denne kjemi Forbindelse I, som inneholder en ferryloksoart og et organisk radikal. Disse strukturene er nøyaktig analoge med a34+⩵O / radikal struktur som forekommer I P i cytokrom oksidase. Det organiske radikalet I Forbindelse I reduseres i et etterfølgende trinn i peroksidase-og katalaseenzymer for å produsere Forbindelse II, som opprettholder ferryloksostrukturen. I oksidase oppstår samme kjemi for å produsere F-mellomproduktet. Likheten i kjemi av de oksygenmetaboliserende hemeproteinene har bare oppstått med realiseringen av a34+⩵o-strukturen For P og antyder at andre oksygenmetaboliserende enzymer kan følge samme type kjemi ved å aktivere og redusere oksygen og peroksider.
en interessant strategi kommer fra Fig. Fig.22 når det gjelder hvordan oksidase par oksygen kjemi til protonpumpen. Pumpetrinnene oppstår først etter At P er dannet (8-10), noe som betyr at enzymet først aktiverer Og reduserer O2 til fullt reduserte, men ufullstendig protonerte produktvannmolekyler; enzymet fullfører fire-elektron-overføringen av elektroner til oksygen, og lagrer den frie energien som resulterer som svært oksiderende a34+⩵O og radikale arter, før pumpen aktiveres. Nylige beregninger på bindingsspaltningskjemien støtter denne ideen, da resultatene indikerer at reduksjon Av O2 til okso og hydrokso med dannelse av en radikal og en ferrylokso er nær termonøytral (23). Dette representerer en bemerkelsesverdig effektiv strategi for å unngå giftige, delvis reduserte oksygenarter, da ingen forekommer i reaksjonssyklusen. Videre, ved å overføre den frie energien som vil bli brukt til å drive pumpen fra substat oksygenprodukter til proteinet, ser det ut som om oksidase har maksimert kontrollen og effektiviteten som den kan betjene proton-translokerende apparatet.