PMC

Under translokasjonstrinnet i forlengelsesfasen av proteinsyntese, blir mRNA avansert med ett kodon, koblet til bevegelse av trna fra ribosomale a (aminoacyl) Til p (peptidyl) og P Til e (utgangssteder), i en prosess katalysert AV forlengelsesfaktor EF-G (1). For DET FØRSTE beveger trnaene seg på 50s-underenheten I P/E og a/P hybridtilstander, etterfulgt av bevegelse av tRNA anticodonstammen (ASLs) fra 30S-underenheten A og P til Henholdsvis p Og E-stedene, koblet til bevegelse av deres tilknyttede mRNA-kodoner (2). Det første trinnet er ledsaget av intersubunit rotasjon (3-7), mens det andre trinnet krever EF-G·GTP, og innebærer rotasjon AV 30s underenhet hodet domene (8-11). Selv om mye nylig har blitt lært om det strukturelle grunnlaget For p-tRNA-bevegelsen Til E-siden (9, 10, 12, 13), translokasjon mellomprodukter som inneholder a-tRNA er vanskeligere å fange. Dermed har mye av vår tenkning om det strukturelle grunnlaget For A-tRNA og mRNA-bevegelsen vært basert PÅ krystallstrukturer AV EF-G bundet til ledige (14) eller P-tRNA-holdige ribosomkomplekser fanget i klassiske (15) eller hybridtilstander (10, 12, 13) og to cryo-EM strukturer AV 70s ribosom-EF-g komplekser som inneholder to trna bundet I P / E og a / p* hybridtilstander (16) , eller i ap/P og pe/E kimære hybridtilstander (11). her rapporterer vi krystallstrukturen til et 70s ribosomtranslokasjonsmiddel som inneholder EF-G, mRNA og to trna – en deacylert tRNA bundet i pe / E-tilstanden og en peptidyl-tRNA fanget i en ap / ap kimær hybridtilstand. Komplekset ble dannet Med t. thermophilus 70s ribosomer, en 39-nukleotid mRNA, elongator tRNAMet I p-området Og N-acetyl-Val-tRNAVal I a-området. For å fange translokasjons mellomproduktet, la vi til neomycin for å blokkere fullføring av translokasjon, og fusidinsyre for å forhindre frigjøring AV EF-G(Supplerende Metoder; Fig. S1). Strukturen ble løst ved hjelp av diffraksjonsdata til 3,8 Å oppnådd fra en enkelt krystall (Tabell S1). Eksempler på elektrontetthet er vist i supplerende materialer (Fig. S2-S13). I forhold til klassisk tilstand ribosom (17) gjennomgår 30s-underenheten hodet en stor 21° mot urviseren, og 30s-kroppen en 2,7° rotasjon i forhold TIL 50S-underenheten (Fig. 1, Fig 2A, B). P-tRNA anticodon stem-loop (ASL) beveger SEG MED 30s-hodet i en posisjon mellom P-stedet PÅ 30s-hodet og E-stedet FOR 30s-kroppen (pe kimær tilstand; Fig 1d, E), mens akseptorenden beveger seg helt inn I 50S E-området (Fig 1C), danner en pe / E kimær hybridtilstand (9-11). A-tRNA ASL beveger seg til innenfor ~4å av p-site-elementene I 30s-kroppen(Fig. 1d); albuen roterer mot det klassiske 50S P-området, men akseptorenden er bundet mellom 50s underenhet A og P-områdene (Fig. 1C), danner en ap / ap kimær hybrid tilstand. Den store, EF-G-avhengige rotasjonen AV 30s-hodet i vår struktur reposisjoner helix H38 AV 23S rRNA, slik At a-tRNA-albuen kan nå posisjonen Til P-site tRNA-albuen (Fig. S14). Domene IV AV EF-G er klemt inn i stedet for konvergens Av a-site mRNA kodon, anticodon sløyfe av ap / ap tRNA, OG 16S og 23s rrna på intersubunit bro B2a, samtidig kontakte alle fire Rna (Fig . S15).

SELV OM 30s hoderotasjon klart letter P-site ASL-translokasjon (9-11), blir A-site ASL translokert av en annen mekanisme. P-stedet ASL beveger seg nøyaktig med 30s hoderotasjon i pe / E-tilstanden, Mens A-stedet ASL har beveget seg lenger enn rotasjonsbevegelsen til hodet i ap-tilstanden PÅ 30S-underenheten (Fig . 1E). Bevegelse av a-site ASL nøyaktig med hoderotasjon vil resultere i alvorlig sammenstøt med domene IV AV EF-G som den er plassert i vårt kompleks, som sammen med kontakten dannet mellom spissen av domene IV OG kodon-anticodon helix av ap/ap tRNA (Fig S16), antyder at bevegelse av mRNA og ASL er koblet til domene IV. den ekstra forskyvningen av ap / ap ASL bringer den nær pe/E ASL (Fig. 2C, D) (11). Posisjonen til hodet kan stabiliseres ved interaksjon mellom fosfat 1210 AV 16s rRNA og domene IV AV EF-G Ved Gly531.Mest slående er omleggingen AV 16s rRNA 966-sløyfen I 30s-hodet, som bryter vekk Fra p-området for å nå Mot A-området, hvor det initierer kontakt med den delvis translokerte ap / ap-ASL (Fig . 2E, F). Denne omleggingen innebærer forstyrrelse av pakningen av m22G966 mot ribose 34 Av P-site ASL (18, 19), og dannelse av en overflatetilpasset lomme rundt ap/ap-ASL ved nukleotider A965, m22G966 Og C1400. I en krystallstruktur av det tilsvarende single-tRNA-komplekset (10) (Fig. S6), ble pe/E tRNA ASL funnet å opprettholde alle kanoniske p-site-kontakter MED 30s-hodet, inkludert 966-sløyfen, når den roterer mot E-stedet. I to-tRNA-komplekset som er rapportert her, opprettholdes imidlertid bare et undersett Av P-site 30S – hodeinteraksjonene med pe / E ASL, som involverer G1338, A1339, A1340 og C-terminal hale av protein uS9. Dannelsen av post-translokasjonsinteraksjoner samtidig med forstyrrelse av pre-translokasjonsinteraksjoner, antyder en mekanisme for hvordan Aslene leveres mellom a-Og P-stedene. Det kan også representere et innledende skifte i kontakter som må forstyrres for å frigjøre pe / E tRNA ASL før tilbakerotering AV 30s-hodet i sluttfasen av translokasjon (20, 21).

nettverket av interaksjoner dannet mellom konservert loop 1 (rester 499-504) i domene IV AV EF-G, ap / ap ASL og dens mRNA kodon (Fig. S15) (11) ligner de som er observert i post-translokasjonstilstanden (15), noe som tyder på at de opprettholdes gjennom hele translokasjonssyklusen. Deres likhet med mindre-groove interaksjoner laget Av A1492 Og A1493 med kodon-anticodon helix i dekoding området (22) tyder på at de kan bidra til å opprettholde riktig kodon-anticodon sammenkobling under bevegelse Mellom a og P steder (15), og er i samsvar med forslaget OM AT EF-G forenkler trans ved destabiliserende interaksjoner I 30s dekoding området (23).

Interaksjoner mellom mRNA og elementer AV 30s-hodet innenfor nedstrøms mrna-inngangstunnelen er foreslått å føre mRNA fremover med tRNA under hoderotasjon (17). Det er imidlertid ikke klart at netto bevegelse av mRNA kan opprettholdes på denne måten, fordi disse interaksjonene forstyrres under hoderotasjon. Vi finner at den utvidede halen av mRNA, som den kommer fra nedstrøms tunnel, kurver oppover for å binde seg til overflaten av protein uS3 i underenheten (Fig . 3, S17). Dermed vil fremoverhoderotasjon aktivt bevege mRNA i retning av translokasjon. Sammenligning av posisjonen til et referansenukleotid på mRNA i de roterte og ikke-roterte tilstandene viser videre at fremoverhoderotasjon vil fremme mRNA med ett kodon(Fig. 3D), som støtter muligheten for at mRNA blir aktivt flyttet av ribosomet under translokasjon. Siden dimensjonene til nedstrøms tunnel utelukker oppføring AV EN RNA-helix, må forstyrrelse av mrna sekundær struktur av ribosomal helikase (24) forekomme ved eller nær inngangen til tunnelen, ved interaksjon med ribosomet utenfor tunnelen. Binding av mRNA-halen umiddelbart flankerer inngangen til tunnelen utelukkende til 30s-hodet gir en slik interaksjon. Kreftene skapt av hoderotasjon kan dermed destabilisere baseparing i spiralformede elementer av mRNA når de går inn i nedstrøms tunnel.

i klassisk tilstand danner C74 og C75 i cca-halen Av P-site tRNA basepar med Henholdsvis G2252 og G2251 i p-sløyfen (H80) AV 23s rRNA, mens C75 Av A-site tRNA parene Med G2553 I a-sløyfen (H92) (18, 25, 26). Disse interaksjonene plasserer peptidyl – og aminoacyldelene for peptidyltransferasereaksjonen (27), som etterlater et deacylert tRNA i P-området og et peptidyl-tRNA i A-området. Et kritisk trinn i translokasjon er derfor den etterfølgende bevegelsen av peptidyl-CCA-enden fra a-sløyfen Til P-sløyfen. Strukturen til translokasjons-mellomproduktet avslører en kimær tilstand, forskjellig fra de som tidligere er beskrevet(Fig. S18), hvor akseptorenden av peptidyl-tRNA interagerer samtidig med Både a-og P-løkkene (Fig 4). I denne tilstanden bevares baseparering Av C75 Med G2553 av a-sløyfen, mens bevegelse av akseptorstammen i en posisjon nær den klassiske p-site tRNA tillater G2252 Og G2253 I en omorganisert p-sløyfe for å kontakte tRNA-ryggraden i posisjoner 72 og 70(Fig . 4B). Dermed er enden av akseptorstammen til ap/ap-tRNA forankret På p-sløyfen, noe som letter overføringen av sine tilstøtende c74 og C75-rester fra a-sløyfen Til P-sløyfen. A76 av ap / ap tRNA er orientert på samme måte som observert for tRNA bundet I p / p klassisk tilstand (17), med sin n-acetyl-valin peptidylgruppe plassert ved inngangen til peptidutgangstunnelen, Mens C74 og C75 opprettholder samspillet Med a-sløyfen PÅ 23S rRNA (Fig. 4, S19).

akseptorenden av ap/ap tRNA kontakter Samtidig a-og P-løkkene PÅ 23S rRNA

under translokasjon beveger 3′ akseptorenden av peptidyl-tRNA fra (a) klassisk a/a-tilstand til (b) mellomliggende ap/ap-tilstand til (C) klassiske P / P-tilstander, tilrettelagt av konformasjonsendringer i a-og P-løkkene.

ap / ap-tRNA kan tilsvare mellomliggende tilstander som har blitt karakterisert kinetisk. Kinetiske studier av fluorescensslokking identifiserte ET EF-G-avhengig mellomprodukt (INT) der peptidyl-tRNA-albuen beveger seg fra a-stedet mot P-stedet, men forblir bare delvis reaktiv med aminoacyl-tRNA-etterligningen av puromycin, noe som tyder på at CCA-enden ikke er fullt innkvartert I P-stedet (28). Kinetiske studier der en sonde ble festet direkte til peptidyl-tRNA CCA-enden, identifiserte EF-G-avhengige translokasjonsmellomprodukter der akseptorenden av peptidyl-tRNA beveger seg mot p-stedet, men forblir puromycin-ureaktiv (29). Egenskapene til disse mellomprodukter er kompatible med fanget ap/ap tilstand observert her. Strukturen til dette fanget translokasjons-mellomproduktet begynner å beskrive hvordan tRNA beveger seg mellom ribosomale a-Og P-steder. Trna-bindingsstedene selv er dynamiske, og danner samtidige kontakter Mellom A-tRNA og elementer av Både a-Og P-stedene, som ligner passering av stafettpinnen i et stafettløp (30). Dette er sett for BÅDE 30s og 50S underenheter. I 30s-underenheten utgir omorganisering av 966-sløyfen til 16S rRNA G966 Fra P-stedet ASL for å kontakte A-stedet ASL når DET beveger SEG inn I 30S P-stedet (Fig. 2E, F). I 50s-underenheten omorganiserer a-og P-løkkene PÅ 23S rRNA for å tillate begge løkkene å kontakte 3 ‘ – akseptorenden av a-site tRNA når den begynner overgangen til 50S P-stedet(Fig . 4). Disse funnene viser at den strukturelle dynamikken til ribosomal RNA spiller en aktiv rolle i translokasjonsmekanismen.