în anii 1970, cea mai mare parte a cromatografiei lichide a fost realizată folosind o fază staționară cu suport solid (numită și coloană) care conține silice nemodificată sau rășini de alumină. Acest tip de tehnică este denumit acum cromatografie în fază normală. Deoarece faza staționară este hidrofilă în această tehnică, moleculele cu proprietăți hidrofile conținute în faza mobilă vor avea o afinitate ridicată pentru faza staționară și, prin urmare, se vor adsorbi la ambalajul coloanei. Moleculele hidrofobe au mai puțină afinitate pentru ambalarea coloanei și vor trece pentru a fi eluate și detectate mai întâi. Eluția moleculelor hidrofile adsorbite în ambalajul coloanei necesită utilizarea mai multor solvenți hidrofili sau mai polari în faza mobilă pentru a deplasa distribuția particulelor în faza staționară către cea a fazei mobile.
cromatografia în fază inversă este o tehnică care utilizează lanțuri alchil legate covalent de particulele de fază staționară pentru a crea o fază staționară hidrofobă, care are o afinitate mai puternică pentru compușii hidrofobi sau mai puțin polari. Utilizarea unei faze staționare hidrofobe este în esență inversul cromatografiei de fază normală, deoarece polaritatea fazelor mobile și staționare a fost inversată – de unde și termenul cromatografie în fază inversă. Cromatografia în fază inversă folosește o fază mobilă polară (apoasă). Ca urmare, moleculele hidrofobe din faza mobilă polară tind să se adsorbească în faza staționară hidrofobă, iar moleculele hidrofile din faza mobilă vor trece prin coloană și vor fi eluate mai întâi. Moleculele hidrofobe pot fi eluate din coloană prin scăderea polarității fazei mobile folosind un solvent organic (nepolar), care reduce interacțiunile hidrofobe. Cu cât molecula este mai hidrofobă, cu atât se va lega mai puternic de faza staționară și cu atât este mai mare concentrația de solvent organic care va fi necesară pentru eluarea moleculei.
multe dintre considerațiile matematice și experimentale utilizate în alte metode cromatografice se aplică și RPC (de exemplu, rezoluția de separare depinde de lungimea coloanei). Poate fi utilizat pentru separarea unei mari varietăți de molecule. Nu este de obicei utilizat pentru separarea proteinelor, deoarece solvenții organici utilizați în RPC pot denatura multe proteine. Din acest motiv, cromatografia de fază normală este mai frecvent utilizată pentru separarea proteinelor. Cu toate acestea, denaturarea proteinelor poate fi de fapt benefică în analiza ulterioară a probelor obținute din cromatografie. Dacă se efectuează o digestie enzimatică cu tripsină pe proteinele analizate, proteina linearizată este mai potrivită pentru aceasta. Prin urmare, denaturarea proteinelor folosind solvenți adecvați care determină desfășurarea proteinelor poate fi de fapt intenționată înainte de a lua proba fracționată prin spectrometrie de masă.
astăzi, RPC este o tehnică analitică frecvent utilizată. Există o varietate de faze staționare disponibile pentru utilizare în RPC, permițând o mare flexibilitate în dezvoltarea metodelor de separare.
faze staționare pe bază de Silicăedit
orice substanță polară inertă care obține o ambalare suficientă poate fi utilizată pentru cromatografia în fază inversă. Cea mai populară coloană este un lanț de carbon octadecil (C18)-silice legată (clasificarea USP L1). Aceasta este urmată de silice legată de C8 (L7), silice pură (L3), silice legată de Ciano (L10) și silice legată de fenil (L11). Rețineți că C18, C8 și fenil sunt rășini dedicate în fază inversă, în timp ce coloanele Ciano pot fi utilizate într-un mod în fază inversă, în funcție de condițiile de analit și fază mobilă. Nu toate coloanele C18 au proprietăți de retenție identice. Funcționalizarea suprafeței siliciului poate fi efectuată într-o reacție monomerică sau polimerică cu diferiți organosilani cu lanț scurt utilizați într-o a doua etapă pentru a acoperi grupările silanolice rămase (acoperire finală). În timp ce mecanismul general de retenție rămâne același, diferențele subtile în chimia de suprafață a diferitelor faze staționare vor duce la modificări ale selectivității.
coloanele moderne au polaritate diferită. PPP este pentafluorfenil. CN este Ciano. NH2 este amino. ODS este octadecil sau C18. ODCN este o coloană de mod mixt formată din C18 și nitril. SCX este un schimb cationic puternic (utilizat pentru separarea aminelor organice). SAX este un schimb anionic puternic (utilizat pentru separarea compușilor acidului carboxilic).