toate metodele au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările relevante. Consimțământul informat a fost obținut de la toți subiecții.
Material
s-au comparat următoarele pansamente argintii: Acticoat( Smith &Nephew, MAREA BRITANIE; menționat în acest articol ca Ac), Aquacel Ag + Extra (Convatec, MAREA BRITANIE; menționat în acest articol ca Aq), Silvercel Hydro-Alginate (Systagenix, MAREA BRITANIE; menționate în prezentul articol ca Sc) și Ialugen Plus (IBI, Republica Cehă; menționate în prezentul articol ca Ia).
alte substanțe chimice au fost obținute de la Sigma–Aldrich (St.Louis, SUA) dacă nu se specifică altfel.
prepararea extractelor
în mai multe teste, s-au folosit mai degrabă extracte din pansamente decât pansamentele în sine. Aceste extracte au fost preparate folosind ser fiziologic (0,9% (g/v) NaCl) sau medii de cultură celulară suplimentate cu 10% ser fetal bovin (FBS). Raportul dintre zona de pansament și soluție a fost de 1 cm2 pe 4 mL de soluție. Extracția a fost efectuată timp de 72 de ore la RT cu agitare constantă. Extractele au fost sterilizate prin trecerea lor printr-un filtru de 0,2 MC și depozitate la 4 mc până la utilizare.
măsurarea concentrației de argint
concentrațiile de argint din pansamente și extractele de pansamente au fost măsurate folosind ICP-OES. Concentrația de argint a fost, de asemenea, evaluată în probele de piele ex vivo porcine. 10-70 mg din fiecare probă a fost transferată într-un vas PTFE pentru digestia cu microunde. Apoi, 1 mL de acid azotic concentrat(trace analysis grade, Analytika Ltd., Republica Cehă), 0.8 mL de acid clorhidric concentrat (trace analysis grade, Analytika Ltd., Republica Cehă) și 0,2 mL de peroxid de hidrogen (p.a. 30%, Penta Ltd., Republica Cehă) au fost adăugate. Proba a fost digerată la 150 centimetric C timp de 5 min și apoi, în a doua etapă a aceluiași ciclu, la 200 centimetric C timp de 10 min. După digestie, proba a fost transferată cantitativ folosind 0,2 mL de peroxid de hidrogen și apă deionizată.
analiza a fost efectuată cu un instrument ICP-OES (Radial 725, Agilent Technologies, Australia) echipat cu un nebulizator pneumatic cu pulverizare marină și cameră de pulverizare ciclonică. Cuantificarea s-a bazat pe calibrarea externă. Precizia și fiabilitatea metodei au fost testate utilizând probe de piele de porcine cu concentrații cunoscute de Ag dintr-o soluție de referință certificată (Analytika Ltd., Republica Cehă).
microscopie electronică de scanare
analizele microscopiei electronice de scanare (Sem) au fost efectuate cu ajutorul unui instrument Zeiss Ultra Plus (Zeiss, Germania). Probele au fost acoperite cu un strat subțire de Au/Pd într-un strat de pulverizare Quorum SC7620. Imaginile au fost luate de două inlens secundare și SE2 detectoare de electroni Pentru mărire mai mare sau mai mică, respectiv. Parametrii de scanare au fost după cum urmează: tensiune de accelerare, 3,5 kV; curentul sondei, 36 pA; și presiunea în cameră, ~ 7 int 10-5 Pa.
imaginile EDX au fost surprinse cu instrumentul Zeiss Ultra Plus. Hărțile cu raze X și spectrele au fost luate de un detector de raze X X-MaxN 80 (Oxford Instruments, MAREA BRITANIE). Parametrii EDX au fost după cum urmează: tensiune de accelerare, 10 kV; curentul sondei, 300 pA; distanța de lucru, 8,5 mm; și timpul de proces, 4 .
activitatea oxidativă directă a pansamentelor
generarea ROS în condiții fără celule a fost evaluată utilizând 3,3′,5,5′-tetrametil-benzidină (TMB) ca substrat pentru peroxidaza de hrean (HRP). Cercuri cu diametrul de 6 mm au fost tăiate din pansamente și testate. Pe scurt, soluția de lucru a constat din 0,1 mg/mL TMB (soluție stoc c = 1 mg/mL în DMSO) amestecată 1:9 cu tampon citrat–fosfat de 0,05 M (pH = 5) și HRP (final c = 0,16 UI/mL). Fiecare bucată de pansament a fost scufundată în 0,5 mL din soluția de lucru și probele (25 ECQ) au fost colectate la 0, 5, 7,5 și 10 min. Imediat după colectare, probele au fost amestecate în raport de 1:1 cu 0,16 m H2SO4 și absorbanța a fost citită la 450 nm (lungimea de undă de referință = 540 nm) folosind un instrument NanoDrop OneC (ThermoFisher Scientific, SUA). 30% H2O2 a fost utilizat ca un control pozitiv. Semnalul de fundal (soluție goală) a fost scăzut.
pătrunderea argintului în pielea deepitelizată
am folosit difuzia statică a celulelor Franz pentru a investiga pătrunderea argintului în pielea deepitelizată. Pielea a fost obținută de la un abator local (Bocus, Letohrad, Republica Cehă) și excizată din partea interioară a auriculei porcine. Părul a fost ras, pielea a fost incubată în PBS (60 C, 90 s), iar epiderma a fost decojită. Grosimea medie a pielii deepitelizate a fost de 2 mm. bucățile de piele au fost plasate într-o cameră și acoperite cu un pansament de argint testat sau o bucată de tifon. Fiecare cameră donatoare a fost umplută cu 0,3 mL de mediu de cultură NHDF cu 10% FBS. Camera acceptorului conținea 0,7 mL de mediu de cultură. Celulele de difuzie au fost incubate la 37 de ore C timp de 24 sau 48 de ore. După incubare, pielea a fost clătită cu PBS, iar părțile pielii care au separat camerele donor și acceptor au fost analizate pentru conținutul de argint folosind ICP-OES, așa cum este descris mai sus. Cantitatea de argint care a pătruns prin pielea deepitelizată a fost măsurată în lichidul donator. Trei replici independente au fost pregătite în ambele momente.
cultivarea pielii ex vivo cu pansamente
auriculele porcine proaspete (1-2 h) au fost curățate scrupulos cu săpun și betadină (o soluție de iod PVP, Egis Pharma, Ungaria) și clătite cu apă. Bucățele de piele (1 ilft 1 cm) din auricule au fost excizate și plasate în soluție antibiotică (soluție penicilină–streptomicină, 10.000 U/mL penicilină, 10 mg/mL streptomicină) timp de 30 min la 37 ilft C sub atmosferă O2 și CO2. Probele de piele cu epidermă intactă au fost plasate cu partea dermică în sus, în plăci de cultivare cu 6 godeuri, cu 3 mL de mediu NHDF suplimentat cu 10% FBS și apoi acoperite cu 1 mie 1 cm de pansament selectat cu conținut de argint sau tifon de control steril îmbibat cu 300 cm de mediu de cultivare. Probele au fost incubate timp de 24 sau 48 de ore. Ulterior, pielea a fost clătită cu PBS și fiecare dintre explantele pielii a fost împărțită în treimi pentru examinare histologică (4% fixare PFA la 4 centimetrii c), analiza proteinelor prin Western blot (congelare rapidă cu azot lichid) și qPCR (peste noapte în RNAlater (Thermo Fisher Scientific), apoi la − 80 centimetrii c).
colorare histologică
colorarea autometalografică a argintului a fost adoptată în conformitate cu Danscher și colab.49. Imaginile au fost capturate folosind un microscop Eclipse 50i cu o cameră DS-Fi1 atașată (Nikon, Yokohama-Shi, Japonia).
pentru imunofluorescența yH2AX, secțiunile histologice de pe lamele de sticlă Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) au fost deparafinizate și incubate peste noapte cu anticorpi primari (1:1000, ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, clona JBW301, Millipore, MA, SUA). Au fost apoi incubate timp de 1 oră cu un anticorp secundar (ab150114, Abcam, Cambridge, Marea Britanie; diluție 1:10 000) și montate pe diapozitive cu montant Antifade ProLong Diamond cu Dapi (ThermoFisher Scientific). Imaginile au fost capturate cu un microscop fluorescent Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japonia).
expresia genelor
pielea porcină după incubare cu pansamente a fost procesată pentru izolarea ARN, sinteza ADNc și expresia genelor qPCR așa cum a fost descrisă anterior de Klein și colab.50 TaqMan teste PCR în timp real (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) utilizate pentru qPCR au fost: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. Valorile ciclului prag au fost normalizate la gena de menaj RPL13A și au fost corelate cu probele de control al tifonului pentru timpul respectiv (interval 24-sau 48−h) utilizând metoda 2-Centictct51. Șase probe independente pentru fiecare tratament și timp au fost măsurate și medii. Semnificația diferențelor în expresia genelor în raport cu controlul tifonului a fost evaluată folosind testul T al elevului pentru fiecare pansament de argint în timpul specificat.
Western blotting
pentru analiza ulterioară Western blot, lizatele tisulare au fost preparate din piele de porc congelată. Folosind un bisturiu într-o picătură de tampon de liză (50 mM Tris pH 8; 150 mM Naci; 1% Triton X-100; 0,5% deoxicolat de sodiu; 1% dodecil sulfat de sodiu; 4% uree), pielea a fost taiata in bucati mici, care ulterior au fost omogenizate in 350 ilqq din tamponul de Liza folosind un talon din inox de 5 mm si un omogenizator de tesuturi (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Germania) timp de 10 min la 25 Hz. Concentrația de proteine a fost măsurată cu ajutorul kitului de testare a proteinelor BCA (Thermo Fisher Scientific).
proteinele din lizați au fost separate folosind pagina SDS cu gradient de 4-15% și transferate pe membranele difluorurii de poliviniliden. Pentru detectarea proteinelor specifice, membranele au fost incubate peste noapte într-un tampon de blocare (20 mm Tris; 137 mm Naci; 0,05% între 20; 5% lapte praf uscat cu conținut scăzut de grăsimi) cu anticorpul primar fosfo-histonă H2A.X (20e3) (1:1.000; semnalizare celulară, SUA). actina a fost utilizată ca un control al încărcării cantității de proteine (1: 2000; Santa Cruz, SUA). Membranele au fost dezvoltate cu IG anti-iepure sau anti-șoarece conjugat cu HRP utilizând detectarea chemiluminescentă pentru a vizualiza semnalele (substrat ECL Clarity Western; Bio-Rad, SUA). Semnalele au fost scanate și evaluate cu un Alliance 9.7 Chroma Chemiluminescence Imaging System (UVItec Limited, Marea Britanie).
activitate antibacteriană
metoda de difuzie a agarului a fost utilizată pentru a compara activitățile antimicrobiene ale pansamentelor. O bucată de probă (1 cm2) din fiecare pansament a fost incubată pe un vas Petri proaspăt inoculat fie cu Staphylococcus aureus, fie cu Pseudomonas aeruginosa; aceste tulpini au fost izolate din răni cronice umane, caracterizate și cultivate conform descrierii anterioare52. În plus, eficacitatea antimicrobiană a extractelor de pansament (preparate în mediu RPMI cu 10% FBS, așa cum este descris mai sus) a fost comparată prin metoda microdiluție53. Densitatea optică a fost măsurată de un cititor de plăci multimod Ensight (PerkinElmer, Waltham, MA, SUA) la 600 nm timp de 24 de ore (agitare, 37 C).
cultura celulară
fibroblastele dermice umane normale din pielea adultă (nhdf) au fost achiziționate de la LONZA (Basel, Elveția). NHDF au fost cultivate în Dulbecco ‘ S Modified Eagles low glucose medium (DMEM) suplimentat cu 10% FBS, glutamină (0,3 mg/mL), glucoză (4 mg/mL), penicilină (100 Unități/mL) și streptomicină (0,1 mg/mL) în flacoane de cultură de 75 cm2 Sub 5% CO2 și la 37 C până la trecerea a cincea. Keratinocitele HaCaT au fost achiziționate de la H Okticlzel Diagnostika (K Okticln, Germania) și au fost cultivate în același mod, dar fără adăugarea de glucoză în mediu.
măsurarea viabilității
cinci mii de celule pe godeu au fost însămânțate peste noapte într-o placă de 96 de godeuri cu 200 ilqtl din mediul de cultură cu 10% FBS într-un incubator (37 ilct C, 5% CO2). În ziua următoare, celulele au fost tratate cu 200 de centicli dintr-o serie de diluții de extracte din pansamente (100%, 50%, 20%, sau 10% din extractul original diluat cu mediu de cultură suplimentat cu 10% FBS) timp de 24, 48 și 72 de ore. Celulele de Control au fost tratate cu un mediu de cultură standard de 10% FBS. Viabilitatea a fost măsurată conform descrierii anterioare54 utilizând testul bromurii de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazoliu (MTT). Soluția stoc MTT (20 ect; c = 5 mg/mL) a fost adăugată în mediul de cultură celulară din fiecare godeu. Plăcile au fost incubate timp de 2,5 ore la 37 C. Apoi, s-a îndepărtat soluția MTT, s-au adăugat 220 ect de soluție de liză (1:1 propan-2-ol cu DMSO, 10% (g/v) Triton X-100 și 0,37% (g/v) HCl) și s-a efectuat Liza timp de 30 min la temperatura camerei pe un agitator rotativ (150 rpm). Absorbanța a fost citită la 570 și 690 nm cu un cititor de plăci Multimode EnSight (PerkinElmer, SUA). Datele au fost prelucrate în Kaleido (PerkinElmer, SUA). Absorbanța finală a fost calculată ca a = A570-A690. Modificarea viabilității celulelor tratate în raport cu celulele de control a fost calculată ca modificare = (a sample/a martor – 1) 100.
testul de inhibare a contactului Direct
celulele au fost însămânțate la o densitate de 300 000 de celule pe godeu într-o placă cu 6 godeuri și incubate în mediul de cultură suplimentat cu 10% FBS la 37 C și sub 5% CO2 până la obținerea confluenței. Pansamentele au fost tăiate în pătrate de 1 cm2, așezate pe stratul celular și incubate cu mediul de cultură standard Timp de 6 ore. celulele de Control au fost tratate numai cu mediul. Ulterior, celulele au fost spălate cu PBS și fixate cu paraformaldehidă 4% Timp de 15 min. Celulele au fost colorate cu 0,1% (g/v) soluție de cristal violet (dizolvată în 10% etanol) timp de o oră și apoi clătite cu apă. Zonele de inhibare au fost fotografiate folosind o cameră digitală Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f (Canon).
colorarea fluorescentă a celulelor
pentru analiza deteriorării ADN-ului, celulele NHDF au fost însămânțate pe diapozitive microscopice într-o placă cu 6 puțuri la o densitate de 2 x,105 pe godeu și lăsate să adere peste noapte. În ziua următoare, celulele au fost tratate cu 5 extracte de pansamente diluate de la 5 la sută și incubate timp de 24 de ore. ulterior, celulele au fost fixate folosind 4% PFA timp de 15 min. După permeabilizare și blocare, lamelele au fost incubate cu un anticorp primar anti-yh2ax rabbit (Cell Signaling, US; diluție 1: 500 într—un tampon de blocare-20% FBS, 0,3 m glicină, 0,05% Tween 20 în PBS; peste noapte; 4 CTC). Detectarea a fost efectuată utilizând un anticorp secundar etichetat cu Alexa Fluor 555 (Abcam, Marea Britanie; 1:500 într-un tampon de blocare; 1 h, RT). Diapozitivele au fost montate folosind Muntele Antifade ProLong Diamond cu DAPI (ThermoFisher Scientific). După ce diapozitivele au fost uscate, imaginile au fost realizate folosind un microscop fluorescent Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japonia).
stresul oxidativ intracelular a fost detectat folosind o sondă DCF-DA, care este sensibilă la concentrația totală de ROS din interiorul celulelor. Celulele au fost însămânțate peste noapte într-o placă cu 24 de puțuri și apoi etichetate cu DCF-DA (1 hectolitru/mL) timp de 15 min, după care au fost tratate cu 5 extracte de pansament diluate de la 5 la sută și incubate la 37 la sută C și sub 5% CO2. 5 mM H2O2 a fost folosit ca un control pozitiv. Fluorescența verde a DCF a fost înregistrată la fiecare 15 minute în timpul unei perioade de incubație de 90 de minute folosind un microscop automat Incucyte S3 (Essen Bioscience, SUA). Cuantificarea fluorescenței intracelulare s-a realizat în software-ul Fiji urmând metoda descrisă de către Centipepa55.
determinarea exploziei oxidative de către neutrofile în sângele integral
un comitet de etică independent a aprobat colectarea probelor de sânge pentru testul de explozie oxidativă neutrofilă și MAT (Comitetul etic pentru cercetare la Universitatea Masaryk, Brno, Cehia, aprobarea nr. EKV-2018-083). Toți donatorii și-au dat acordul scris.
explozia oxidativă (producția de ROS) a fagocitelor din sânge a fost determinată în sângele integral diluat prin chemiluminiscență îmbunătățită cu luminol (CL) utilizând un luminometru microplacă lm-01t (Immunotech, Republica Cehă). Pe scurt, amestecul de reacție a constat din 6 ect de sânge integral în 54 ect de mediu de creștere RPMI-1640 amestecat cu 60 ect de extract de pansament în soluție salină fiziologică sau un mediu suplimentat cu FBS. Acest amestec a fost incubat la 37 centimetric C timp de 20 min. Chiar înainte de începerea măsurării, am adăugat luminol de 1 mM (o soluție stoc de luminol de 10 mM într-un tampon de borat de 0,2 m) (sonde moleculare, SUA). Am determinat producția spontană de ROS și producția de ROS indusă de particule opsonizate de zymosan (OZP-0,1 mg/ mL) (Sigma-Aldrich, SUA) sau phorbol 12-miristat 13-acetat (PMA-0,8; Sigma-Aldrich, SUA). Probele netratate fără extractele testate au fost evaluate ca martor. Testele au fost efectuate în duplicate. Chemiluminescența s-a înregistrat continuu timp de 90 min la 37 CTC și s-a exprimat în unități de lumină relativă (RLU). Am determinat cantitatea totală de producție de ROS din zona integrată de sub curba de chemiluminescență.
testul de activare a monocitelor (MAT)
MAT a fost efectuat în sânge uman integral heparinizat, diluat cu soluție salină, în 10%. Probele de sânge au fost colectate de la cinci donatori sănătoși, reuniți și diluați cu soluție salină. Probele de sânge diluate au fost incubate cu cercuri cu diametrul de 6 mm tăiate din pansamente în microtuburi sterile timp de 24 h la 37 C. În paralel, lipopolizaharidă (LPS, final c = 0. 25 UI/mL; e-Toxatul standard de endotoxină; Sigma, SUA) a fost adăugat la a doua serie de probe incubate cu probe de pansament pentru a stimula un răspuns imun înnăscut la bacterii. Celulele sanguine sedimentate în timpul incubării, lăsând o fază superioară a plasmei diluate cu soluție salină. După incubare, s-au colectat 200 unqql din fiecare probă de plasmă diluată cu soluție salină și s-au testat imediat în duplicate pentru IL-6 folosind un Kit Elisa uman IL-6 neacoperit conform protocolului producătorului (ThermoFisher Scientific, SUA). Absorbanța a fost citită folosind un cititor de plăci multimod EnSight (PerkinElmer, SUA), iar concentrația finală de IL-6 a fost calculată de Kaleido SW (Perkin Elmer, SUA). Plasma rămasă și celulele sedimentate au fost stocate la 4 centimetrii C pentru evaluarea hemolizei și a toxicității.
hemoliza
hemoliza a fost detectată în plasma diluată cu soluție salină rămasă și în celulele sedimentate din MAT. După centrifugare, 100 de centicli din fiecare probă au fost transferați pe o microplacă cu 96 de puțuri și absorbanța a fost măsurată la 550 nm. 1% Triton X-100 a fost utilizat ca un control pozitiv.
eliberare LDH
toxicitatea pansamentelor argintii asupra celulelor sanguine a fost evaluată prin intermediul testului lactat dehidrogenază (LDH) (citotoxicitate detection KitPLUS, Roche, Elveția) conform instrucțiunilor producătorului. Au fost utilizate două surse de celule sanguine—sânge integral uman incubat cu pansamente de argint ca în MAT și neutrofile izolate. Absorbanța utilizată pentru corecția de fond a fost măsurată în probe martor fără reactivul LDH. Rezultatele sunt raportate ca valori absolute ale densității optice comparativ cu un eșantion netratat.
analiza statistică
dacă nu se specifică altfel, testul T Student a fost utilizat pentru a evalua semnificația statistică a diferențelor dintre probe și controalele netratate.