Efectul colesterolului asupra structurii unui bistrat fosfolipidic

cuvinte cheie:

• biomembrana
• simulare moleculară
• comportament de fază
• dimiristoilfosfatidilcolină
• model mezoscopic

în acest articol abordăm o întrebare termodinamică aparent simplă: cum se schimbă aria per moleculă a unei membrane fosfolipidice dacă adăugăm colesterol? Această întrebare a fost pusă pentru prima dată de Leathes (1) în 1925 și este încă discutată astăzi. Semnificația acestei întrebări se referă direct la importanța colesterolului pentru funcționarea membranelor eucariotelor superioare. De exemplu, colesterolul reglează fluiditatea membranei și modulează funcția proteinelor membranare (2). Înțelegerea acestor mecanisme a motivat mulți cercetători să investigheze în detaliu interacțiunile lipide-colesterol. Deoarece o membrană poate fi văzută ca un lichid 2D, o primă estimare a modului în care aria pe moleculă s-ar schimba la adăugarea colesterolului ar fi să presupunem amestecarea ideală, unde aria pe moleculă este pur și simplu o medie ponderată a zonelor componentelor pure. În 1925, Leathes a arătat că, în loc de amestecare ideală, se observă un comportament nonideal izbitor (1). Acest comportament nonideal se numește efect de condensare (3) deoarece aria pe moleculă este mult mai mică în comparație cu amestecarea ideală. Deoarece o membrană se comportă ca un fluid incompresibil, o scădere a ariei pe moleculă va duce la o creștere semnificativă corespunzătoare a grosimii totale a bistratului. O astfel de creștere a grosimii semnalează o reorganizare a structurii membranei. Deoarece modificările în structura membranei pot avea consecințe importante pentru funcționarea proteinelor (2), este important să avem o mai bună înțelegere moleculară a modificărilor induse de colesterol.

au fost propuse diferite modele conceptuale pentru a explica interacțiunile nonideale colesterol–lipide. Exemplele includ modelul complexelor condensate (4, 5), modelul superlattice (6) și modelul umbrelă (7). Modelul complexelor condensate explică efectul de condensare presupunând că colesterolul induce formarea reversibilă a unui complex stoichiometric colesterol–lipidic. Într-un astfel de complex, membrana este condensată, deoarece lanțurile acil lipidice sunt mai ordonate. La o concentrație dată de colesterol, există o compoziție de echilibru între aceste complexe condensate colesterol–lipide și lipide obișnuite. Modelul superlattice presupune că, la concentrații critice, moleculele de colesterol prezintă o ordine specifică de lungă durată. Modelul umbrelă consideră că partea hidrofilă a colesterolului este prea mică și, prin urmare, lipidele trebuie să contribuie la screeningul moleculelor de colesterol din interacțiunile hidrofobe cu apa. Fosfolipidele pot crea această umbrelă numai dacă aceste molecule se îndreaptă pentru a face spațiu pentru colesterol. În aceste modele, mecanismele de bază care conduc la condensare sunt foarte diferite. Interesant, un studiu experimental recent a concluzionat că datele lor au susținut modelul complexelor condensate (8), în timp ce un alt set de experimente nu a găsit nicio indicație a complexelor condensate și a susținut modelul umbrelă (9). Aceste diferențe în intuiții ne–au motivat să dezvoltăm un model mezoscopic al unui sistem lipidic–colesterol-apă. Am folosit simulări moleculare pentru a arunca o lumină asupra organizării laterale a colesterolului în membranele lipidice și a interacțiunilor lipid–colesterol care induc efectul de condensare.mai multe simulări moleculare ale tuturor atomilor și modelelor cu granulație grosieră ale colesterolului în bistraturile lipidice au fost raportate în literatură (pentru câteva exemple recente, vezi refs. 10-13 și referințele din acestea). În mod ideal, s-ar dori să se utilizeze simulări all-atom pentru a studia efectul de condensare pe o gamă largă de temperaturi și compoziții. În prezent, însă, aceste simulări consumă prea mult timp. Prin urmare, folosim un model cu granulație grosieră, în care eficiența este câștigată prin integrarea unor detalii ale unui model cu totul atom. Modelul nostru se bazează pe modelul Kranenburg și colegii (14, 15). Modelul folosește molecule explicite de apă. Lipidele și colesterolul constau din particule hidrofile și hidrofobe (vezi Fig. 1). Acest model grupează grupuri de atomi într-un singur pseudoatom mezoscopic. Interacțiunile intramoleculare includ vibrațiile de legătură și îndoirea legăturilor dintre care parametrii au fost optimizați pentru a imita structura unei singure molecule de fosfatidilcolină cu toți atomii în apă. Interacțiunile hidrofile și hidrofobe sunt descrise cu interacțiuni soft-repulsive, iar parametrii acestor interacțiuni sunt legați de parametrii de solubilitate prin utilizarea metodei descrise De Groot și Rabone (16). Ideea acestui model este că principalele forțe motrice ale amestecului colesterol-fosfolipide sunt interacțiunile hidrofobe și hidrofile, ceea ce este concluzia multor studii experimentale (7, 9, 17). În modelul nostru, unitatea de lungime este direct legată de dimensiunea efectivă a unui pseudoatom, adică un pseudoatom ocupă un volum de 90 Unkto3. Unitatea de energie rezultă din potrivirea parametrilor de respingere moale a particulelor de apă mezoscopice cu compresibilitatea apei în condiții ambientale. Simplitatea modelelor necesită o reparameterizare a acestor repulsii moi dacă temperatura este schimbată. Cu toate acestea, în această lucrare, presupunem că parametrii sunt independenți de temperatură. Scara de temperatură este setată prin montarea la temperaturile de tranziție în fază experimentală. Mai multe detalii și aplicații ale acestui model pot fi găsite în ref. 18.

modelul nostru de colesterol, prezentat în Fig. 1B, se bazează pe aceleași ipoteze cu privire la dimensiunea efectivă și interacțiunile ca modelul lipidic. După McMullen și colab. (19), am făcut partea hidrofobă a modelului colesterolului puțin mai lungă decât partea hidrofobă a modelului lipidic, care își propune să reprezinte dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC). Pentru simplitate, am presupus că interacțiunile hidrofobe și hidrofile ale unei molecule de colesterol sunt similare cu cele dintr-o lipidă. Pentru a obține o perspectivă asupra mecanismului molecular al efectului de condensare a colesterolului, am introdus trei molecule asemănătoare colesterolului în care perturbăm echilibrul hidrofob-hidrofil al moleculei: una în care scădem lungimea cozii hidrofobe (vezi Fig. 1C), una în care adăugăm un grup hidrofob suplimentar (Fig. 1D) și unul în care înlocuim inelul cu un lanț simplu (Fig. 1E).

Fig. 2 prezintă diagrama de fază a compoziției temperaturii calculate a sistemului apă–fosfolipid–colesterol. Limitele de fază au fost obținute dintr-o inspecție vizuală a instantaneelor și, mai cantitativ, din punctele de inflexiune ale curbelor care dau aria per lipidă, grosimea medie hidrofobă a membranei și parametrii de ordine și înclinare a cozii. Aceste proprietăți au fost calculate în funcție de temperatură și conținutul de colesterol.

să ne concentrăm mai întâi pe fazele lipidice pure, iar efectul colesterolului va fi discutat în continuare. Pentru bistratul pur-lipidic, diagrama de fază a fost calculată de Kranenburg și Smit (14) pentru un sistem care este de patru ori mai mic. Am folosit aceeași metodologie pentru a localiza limitele de fază așa cum au făcut Kranenburg și Smit (14). Rezultatele noastre sunt în acord excelent cu acest studiu, ceea ce indică faptul că efectele de dimensiuni finite sunt mici. Pentru fosfolipidul pur, observăm la temperaturi ridicate o fază lichidă (La) în care cozile sunt dezordonate. La temperaturi scăzute, cozile sunt ordonate și înclinate, ceea ce definește faza de gel (L ‘ C). Aceste două faze sunt separate de faza ondulată (p ‘ XV), în care observăm o separare microfazică a domeniilor în care bistratul este gros și lipidele sunt ordonate și domenii în care bistratul este subțire și lipidele dezordonate. Prezența acestor trei faze indică faptul că diagrama de fază rezultată este în acord foarte bun cu diagrama experimentală a lipidei pure (20). Scara de temperatură este setată prin potrivirea temperaturilor tranzițiilor de fază ale fazei gel cu faza de ondulare (Tp) și faza de ondulare cu faza lichidă (Tm) cu temperaturile de tranziție de fază experimentală corespunzătoare ale DMPC pur. O comparație suplimentară cu datele experimentale se face pentru aria medie pe moleculă a bistratului (Fig. 3A), pentru grosimea stratului dublu (Fig. 4A) și pentru ordinea cozii lipidice (Fig. 4B). Pentru aria per lipidă se obțin 56 XQ2 per moleculă comparativ cu cea experimentală (21) 60 XQ2 per moleculă. Pentru grosimea bistratului s-a calculat o valoare de 38,7 inkt, care se compară bine cu valoarea experimentală de 36 Int (21), și se obține un acord similar pentru ordinea cozii (vezi Fig. 4B). Pentru a calcula aria pe moleculă pentru colesterolul pur, am simulat un strat dublu de colesterol pur. S-a obținut o valoare de 40,3%, care se compară foarte bine cu cea mai recentă valoare experimentală de 41% (22) pentru un monostrat de colesterol. Având în vedere aproximările făcute în modelul nostru, acordul dintre valorile experimentale și cele simulate este surprinzător de bun.

să ne întoarcem acum la efectul colesterolului asupra proprietăților bistratului. Prima întrebare pe care o vom aborda este dacă modelul nostru poate reproduce efectul de condensare. Fig. 3A arată efectul colesterolului asupra zonei per moleculă în funcție de concentrația de colesterol. Comparația cu datele experimentale arată încă o dată un acord foarte bun. În această figură arătăm, de asemenea, aria pe moleculă presupunând amestecarea ideală. Această cifră ilustrează în mod convingător efectul de condensare; aria pe moleculă scade mult mai mult decât s-ar aștepta pe baza amestecării ideale. Alte date experimentale includ efectul colesterolului asupra umflăturii cu două straturi (Fig. 4A) și parametrul ordine coadă (Fig. 4B). Atât datele experimentale, cât și simularea arată că colesterolul crește grosimea stratului dublu și ordinea acestuia. De asemenea, pentru aceste două proprietăți, rezultatele noastre de simulare sunt în acord foarte bun cu datele experimentale. Simularea și datele experimentale (Fig. 3A și 4 A și B)arată că adaosul de colesterol modifică puternic proprietățile bistratului lipidic până la 30 mol % colesterol. După aceasta, se ajunge la o regiune în care adăugarea suplimentară de colesterol are doar un efect ușor. La 30 mol % colesterol, atât aria pe moleculă, cât și parametrii de ordine și înclinare a cozii lipidice au valori tipice pentru faza de gel.

codificarea culorilor din Fig. 2 arată diferența dintre zona simulată per lipidă și valoarea estimată prin asumarea amestecării ideale. Observăm că la temperaturi ridicate și scăzute, efectul de condensare este relativ mic. Efectul de condensare este maxim într-o regiune bine definită în spațiul de fază care este situat chiar deasupra tranziției de fază principală a fosfolipidului pur. Pentru a înțelege mai bine natura efectului de condensare, este important să înțelegem efectul adăugării colesterolului asupra comportamentului de fază al membranei.

Fig. 2 prezintă cele mai importante caracteristici ale diagramei de fază. Diferitele faze pe care le-am observat în simulările noastre au fost observate și experimental, deși nu întotdeauna pentru amestecul specific de DMPC și colesterol (20, 23, 24). Cu toate acestea, diferitele studii experimentale arată diagrame de fază calitativ foarte diferite, ceea ce limitează posibilitățile noastre de a face o comparație detaliată. Instantanee ale diferitelor faze pot fi găsite în Fig. 5.

la temperaturi foarte ridicate, adăugarea de până la 50 mol% colesterol are un efect redus asupra structurii membranei și observăm faza La pentru toate concentrațiile (24). La temperaturi sub Tp, observăm că colesterolul modifică structura fazei de gel prin inhibarea înclinării cozilor lipidice, determinând formarea fazei L ‘ C (20) (comparați Fig. 5 D cu E). La concentrații mai mari de colesterol (>20%), observăm formarea unor clustere mici, bogate în colesterol. Denotăm această fază prin LII, iar această fază este prezentată în Fig. 5E. la temperaturi între Tp și Tm, bistratul pur se află în faza de ondulare, iar colesterolul transformă această fază de ondulare (vezi Fig. 5C) într-o fază ordonată în lichid (23) (Fig. 5B). Termenul fază ordonată de lichid a fost introdus de Ipsen și colab. (25). Grosimea stratului dublu este intermediară între grosimea lichidului și faza de gel. Parametrii de ordine a cozii lipidice au valori apropiate de faza gelului; cu toate acestea, spre deosebire de faza gelului, lipidele sunt mai dezordonate și nu se înclină. Colesterolul crește treptat temperatura la care are loc tranziția de fază La La Lo. La concentrații foarte mari de colesterol, faza ordonată de lichid se transformă într-o fază de gel (LII) atunci când temperatura este scăzută sub Tm. Această fază a fost observată experimental pentru dipalmitoilfosfatidilcolină (26), dar nu am găsit date experimentale pentru DMPC în aceste condiții. Să revenim acum la efectul de condensare. Fig. 2 arată că efectul de condensare este maxim la o temperatură chiar deasupra tranziției principale Tm. Motivul este că, în aceste condiții, bistratul pur se află într-o stare dezordonată lichid, în timp ce adăugarea de colesterol la bistrat îl transformă într-o fază ordonată lichid, care are o suprafață per lipidă mult mai mică în comparație cu starea dezordonată lichid. Această diferență mare provoacă un efect mare de condensare. La temperaturi mai ridicate, faza lichidă rămâne stabilă pentru toate concentrațiile de colesterol, dând un efect de condensare mult mai mic. La temperaturi mai scăzute, bistratul lipidic pur are o suprafață per lipidă care este mult mai aproape de zona per lipidă a fazei ordonate de lichid și, ca urmare, efectul de condensare este mult mai mic.

rezultatele de mai sus indică faptul că efectul de condensare este o consecință directă a anumitor modificări ale comportamentului de fază pe care îl induce colesterolul. În literatura de specialitate există diverse speculații cu privire la acele aspecte ale structurii colesterolului care sunt responsabile în mod specific pentru efectul său de condensare. De exemplu, modelul umbrelă se bazează pe noțiunea că, în comparație cu fosfolipidele, partea hidrofilă a colesterolului este mult mai mică și are nevoie de fosfolipid, ca umbrelă, pentru screening suplimentar din interacțiunile cu apa. Acest lucru sugerează că un grup hidrofil suplimentar ar schimba complet proprietățile. Un alt factor important este structura inelului voluminos; dacă înlocuim inelul cu o coadă, obținem o moleculă care seamănă mai mult cu o moleculă de alcool (27). Cu toate acestea, scurtarea cozii hidrofobe ar avea un efect redus. Fig. 1 prezintă moleculele de colesterol modificate care imită aceste modificări. Într-adevăr, rezultatele din Fig. 3B arată că scurtarea coada colesterolului arată același efect de condensare. Cu Toate Acestea, Fig. 3B arată că pentru ambele modificări ale moleculei de colesterol, adăugând o grupare hidrofilă suplimentară și înlocuind inelul cu un lanț liniar, nu se observă niciun efect de condensare. Observăm efectul opus: adăugarea acestor molecule face ca bistratul să devină mai extins în comparație cu amestecarea ideală. Efectul alcoolilor (mai mici) asupra ariei pe moleculă a fost măsurat experimental, iar datele experimentale arată, de asemenea, o creștere (28). În strânsă legătură cu aceasta, am observat că pentru ambele cazuri în diagrama de fază faza lichidă a fost stabilă pe întregul interval de concentrație. De fapt, observăm că adăugarea acestor molecule scade temperatura principală de tranziție și, prin urmare, nu există nicio regiune în diagrama de fază în care să existe un efect mare de condensare.simulările cu aceste variații structurale ale colesterolului indică cât de surprinzător de subtil este mecanismul. Tranziția principală într-un strat dublu pur este foarte sensibilă la interacțiunile hidrofobe. Grupurile de cap ale lipidelor ecranează cozile hidrofobe din apă. La temperaturi ridicate, zona per lipidă este ridicată, iar acest screening este departe de a fi optim; dar în aceste condiții domină entropia lanțului. Scăderea temperaturii face din ce în ce mai importantă ecranarea interacțiunilor hidrofobe și la tranziția principală induce în cele din urmă o ordonare a lanțurilor. Un aspect cheie este înțelegerea modului în care colesterolul destabilizează faza lichidă. Colesterolul are un cap hidrofil mai mic și, prin urmare, este mai puțin eficient în protejarea interacțiunilor hidrofobe. La temperaturi ridicate, bistratul lipidic poate găzdui acest lucru, dar la temperaturi mai scăzute lipidele pot contribui doar la screeningul colesterolului prin scăderea ariei sale pe lipide. Acest lucru determină ordonarea observată și explică de ce crește tranziția principală. Cele două modificări pe care le-am introdus în structura colesterolului influențează screeningul hidrofob; în ambele variante, scăderea intrinsecă a colesterolului dispare. Dacă aceste molecule sunt adăugate la stratul dublu, nu este nevoie de screening suplimentar al interacțiunilor hidrofobe, iar aceste molecule împiedică formarea unei faze ordonate.

să comparăm observațiile noastre cu modelele anterioare care au fost introduse pentru a explica efectul de condensare. În primul rând, modelul nostru nu oferă nicio indicație a comenzii pe distanțe lungi, așa cum se presupune în modelul superlattice. Implicit atât în modelul umbrelă, cât și în complexele condensate este presupunerea unui fel de organizație locală. De exemplu, în modelul umbrelă se presupune că o moleculă lipidică ar putea examina una sau două molecule de colesterol vecine (a se vedea, de exemplu, ref. 2). Simulările noastre arată o structură mult mai dezordonată în care nu putem identifica aceste structuri ordonate. În acest moment este important să reamintim că modelul nostru conține multe ipoteze, iar acest lucru ridică întrebarea dacă concluziile pe care le tragem din simulările noastre sunt relevante pentru sistemele experimentale. Am fost foarte surprinși să vedem că am reușit să obținem un comportament de fază atât de bogat folosind un model cu granulație grosieră care folosește forțe pur respingătoare. Modelul nostru oferă o descriere cantitativă foarte rezonabilă a datelor experimentale recente privind structura bistratului. Un alt aspect interesant este că calculele noastre prezic că efectul de condensare este maxim într-un interval de temperatură îngust deasupra tranziției principale. Ar putea fi posibil să se verifice acest lucru experimental. Un test foarte strict al modelului nostru ar fi fost o comparație detaliată cu diagrama de fază experimentală. În acest context, este încurajator faptul că fazele pe care le-am găsit au fost observate experimental, deși nu întotdeauna exact pentru sistemul simulat. Selectând cu atenție acele date experimentale care sunt de acord cu simulările noastre, am putea chiar să pretindem un acord foarte bun. Un posibil motiv pentru dezacordul dintre diferitele experimente este că se folosesc diferite tehnici și nu toate tehnicile sunt la fel de sensibile la diferențele în structura diferitelor faze. Sperăm că combinația dintre o diagramă de fază și informații detaliate despre structura diferitelor faze oferă câteva linii directoare cu privire la faptul dacă o anumită tehnică experimentală poate identifica o anumită tranziție de fază.