există adesea multă confuzie cu privire la semnificația „unităților enzimatice”, „activității enzimatice” și „activității enzimatice specifice”. Acest ghid explică aceste concepte cheie în termeni simpli și discută proiectarea testului enzimatic și importanța funcționării în intervalul liniar. De asemenea, luăm în considerare curbele standard și dacă ar trebui să trasați concentrația sau cantitatea absolută de produs pe axa X. Sunt discutate câteva sfaturi despre Configurarea controalelor de testare și scăderea semifabricatelor. În cele din urmă, explicăm modul în care sunt calculate valorile activității enzimatice și oferim o imagine de ansamblu simplă a ecuațiilor cinetice.
definițiile Unităților enzimatice
enzimologia ar fi mai puțin complicată dacă toată lumea ar folosi aceeași definiție a unității. O definiție standard a unității este dată mai jos:
1 unitate (U) este cantitatea de enzimă care catalizează reacția a 1 umol de substrat pe minut (definiția a).
în majoritatea setărilor R&D, 1 umol de substrat este de fapt destul de mult material și alte definiții pot fi preferate pentru a evita exprimarea cantităților în fracțiuni de unități. Următoarea definiție non-standard este frecvent utilizată:
1 unitate (U) este cantitatea de enzimă care catalizează reacția a 1 nmol de substrat pe minut (definiția B).
rețineți că modificarea definiției are un efect profund asupra numărului declarat de unități, adică 1 unitate de enzimă conform definiției A ar echivala cu 1000 de unități conform definiției B!
puteți vedea, de asemenea, unități enzimatice exprimate ca Mili-unitate (sau mU), ceea ce înseamnă pur și simplu o miime dintr-o unitate, indiferent de modul în care unitatea a fost definită.
în mod clar, cantitatea reală a unei enzime dintr-un tub nu este modificată pur și simplu prin schimbarea definiției unității, dar este necesară o atenție deosebită atunci când se compară activitățile probelor de la diferiți furnizori. Atâta timp cât sunt furnizate definițiile unității, puteți transforma numărul declarat de unități în nmol pe minut, ceea ce este lipsit de ambiguitate și permite efectuarea de comparații valide.
pentru claritate în propria lucrare, puteți prefera să utilizați ‘nmol pe minut’ (sau ‘umol pe minut’), deși dacă este necesară repetarea constantă, atunci în mod clar termenul mult mai scurt ‘unitate’ are atracțiile sale.
ce este ‘activitatea enzimatică’
activitatea este citată în unități pe ml (U / ml), cu alte cuvinte nmol pe minut pe ml (dacă a fost adoptată definiția unității B). Astfel, valorile activității exprimate în unități sunt, de asemenea, supuse unei ‘creșteri’ iluzorii de 1000 de ori dacă se trece de la definiția unității A la definiția unității B. Din nou, nu poate exista nici o confuzie dacă activitatea este exprimată în termeni de nmol pe minut pe ml, mai degrabă decât unități pe ml.
deoarece activitatea se referă la concentrație, rezultă că două flacoane de enzimă pot conține același număr de unități (în total), dar au activități (concentrații) diferite.
ce este activitatea enzimatică specifică?
activitatea enzimatică specifică (de obicei menționată simplu ca ‘activitate specifică’) este numărul de unități enzimatice pe ml împărțit la concentrația de proteine în mg / ml. Prin urmare, valorile specifice ale activității sunt citate ca unități/mg sau nmol/min/mg (dacă se aplică definiția unității B).
activitatea specifică este o măsură importantă a purității enzimei, iar valorile pentru diferite loturi ale unei enzime pure ar trebui să fie aceleași, în cadrul unei erori experimentale normale.
diluțiile seriale ale unei soluții enzimatice vor avea valori diferite ale activității enzimatice, dar valori identice ale activității specifice, deoarece în calculul activității specifice numărătorul (unități/ml) și numitorul (mg / ml) sunt afectate în mod egal de diluarea probei.
deși activitatea specifică este foarte diferită de activitate, calculul activității specifice este totuși dependent de valoarea activității și, prin urmare, valoarea specifică a activității va depinde și de definiția unității enzimatice. Loturile care sunt sub valoarea preconizată a activității specifice pot conține impurități sau molecule enzimatice care au devenit denaturate.
factori care afectează activitatea enzimei
în această secțiune vom discuta De ce o enzimă poate avea valori diferite ale activității măsurate în laboratoare diferite. Prin aceasta înțelegem diferențe reale în activitatea măsurată, nu diferențe aparente cauzate de utilizarea diferitelor definiții ale unităților.
condițiile în care se efectuează o analiză vor influența valorile activității raportate. De exemplu, testele se efectuează în mod obișnuit la o temperatură cuprinsă între 20-37 CTF C. În general, o enzimă va fi mai activă la 37 CTF c decât la 20 CTF C.
definiția unității enzimatice ar fi mai bine exprimată astfel:
1 unitate (U) este cantitatea dacă enzima care catalizează reacția de 1 nmol de substrat pe minut în condiții standard.
Din păcate, termenul”condiții standard”este deschis interpretării și pot exista preferințe diferite ale utilizatorului, cel puțin în mediile R&D. Astfel, zece laboratoare de cercetare diferite pot calcula (destul de corect) diferite activități pentru aceeași soluție de enzimă. Majoritatea laboratoarelor de cercetare își stabilesc propriile condiții standard și verifică fiecare lot nou pe plan intern. În setările clinice, condițiile standard sunt definite în mod explicit și toate laboratoarele sunt necesare pentru a rula teste identice.
teste de dezvoltare și importanța intervalului liniar
valoarea activității (unități / ml) pentru enzima dumneavoastră este cel mai important parametru atunci când dezvoltați un test. Acest lucru se datorează faptului că volumul (adică numărul de unități) pe care îl adăugați va determina cantitatea de substrat care este transformată în produs. Amintiți-vă, 1 unitate catalizează conversia a 1 nmol de substrat pe minut (definiția B).
unitățile / ml raportate vă pot oferi o idee aproximativă despre cantitatea de enzimă de adăugat, dar, deoarece valoarea activității poate să nu fi fost determinată într-un test identic cu al dumneavoastră, este obișnuit să preparați diluții seriale ale enzimei (de exemplu, diluții log inițial) și să testați un volum fix al fiecărei diluții. În funcție de semnalul de testare (care va fi legat de cantitatea de substrat convertită), poate fi necesar un al doilea experiment pentru a intra acasă într-o diluție adecvată.
care este cea mai bună diluție? Pentru a răspunde la acest lucru, trebuie să ne gândim la cel mai important aspect al designului testului – gama liniară. Este important ca munca cantitativă să funcționeze într-un interval în care un grafic al semnalului de testare (adesea absorbanță) față de concentrația enzimei este liniar. Majoritatea testelor sunt liniare dacă gradul de conversie a substratului este mai mic de 15%, presupunând că nu există alți factori limitativi. Prin fixarea timpului de testare (de exemplu, 30 min) și a temperaturii (de exemplu, 25oC), gradul de conversie poate fi controlat prin simpla ajustare a unui parametru, adică a numărului de unități enzimatice adăugate.
Acest lucru este ilustrat grafic în Figura 1 cu diluții exprimate ca reciprocale (adică diluție de 1/10 = 0,1 pe axa x). Parcela dvs. poate diferi în formă și interval liniar, dar la o concentrație foarte mare de enzime, fără îndoială, semnalul de testare nu va crește proporțional cu cantitatea de enzimă adăugată.
testul din Figura 1 este liniar până la densitatea optică (OD) 2.5 și un factor de diluare de 0.02 (diluție 1/50 a enzimei) ar fi ideal pentru munca de testare, deoarece dă un semnal mare (~1.5) și se află în mijlocul intervalului liniar. Calculele bazate pe rezultate pentru factorii de diluare în intervalul cuprins între 0,04 și 0,12 (adică regiunea cu pantă redusă) vor subestima nivelul real al activității enzimei, deoarece ceva limitează în mod clar magnitudinea semnalului de testare.
mulți factori pot funcționa pentru a limita intervalul liniar, iar intervalul va varia de la test la test. Un motiv comun pentru neliniaritate este consumul excesiv de substrat, care poate determina scăderea vitezei de reacție, dar limitările componentelor optice ale cititorului de plăci (sau orice dispozitiv de măsurare utilizat) pot fi, de asemenea, semnificative. Majoritatea cititoarelor de plăci, de exemplu, nu pot măsura în mod fiabil valorile absorbanței peste 3 și această limitare se va aplica indiferent de procentul substratului care a fost transformat în produs.
Fig 1. Deși nu se discută altfel în acest ghid, trebuie să fim conștienți de faptul că enzimele se pot denatura în timp, mai ales dacă sunt foarte diluate, iar produsele unor reacții pot inhiba enzima. Într-adevăr, există și alte motive posibile pentru comportamentul neliniar, dar este de obicei relativ ușor să găsiți intervalul liniar prin încercări și erori folosind diluții seriale ale enzimei așa cum este descris mai sus.
timpul și temperatura testului
acești parametri pot influența, de asemenea, intervalul liniar, deoarece afectează rata de conversie a substratului. De exemplu, un test poate fi liniar după 15 minute, dar la 60 de minute s-a consumat prea mult substrat. În această situație, ar trebui să reduceți cantitatea de enzimă pentru a efectua testul timp de 60 de minute. Aceleași considerații se aplică temperaturii de testare, deoarece poate afecta și viteza de reacție.
majoritatea oamenilor adoptă un timp de testare de undeva între 15 min și 60 min. Timpii foarte scurți (de exemplu, 2 minute) trebuie evitați, deoarece o ușoară întârziere în oprirea reacției va duce la o eroare semnificativă în calculele activității. Este important să vă asigurați că reactivii depozitați în frigider sau congelator au fost echilibrați la temperatura corectă înainte de utilizare, iar acest lucru este important mai ales dacă aveți un timp de testare relativ scurt.
volumul/sensibilitatea testului
Din punct de vedere practic, volumul testului este determinat / limitat de elementul consumabil pe care îl utilizați pentru testele dvs. (de exemplu, cuve, tuburi sau microplăci). Semnalul pentru majoritatea testelor enzimatice este proporțional cu volumul testului și încercările de miniaturizare a testului (de exemplu, pentru conservarea reactivilor) vor duce de obicei la semnale mai mici. Cu toate acestea, testele de absorbție sunt adesea o excepție, iar trecerea de la o cuvă de 3 ml la micro-cuvă de 1 ml, de exemplu, nu va schimba citirea absorbanței dacă lățimea (lungimea căii) cuvei este încă de 1 cm (adică. lumina încă trece prin aceeași’ lungime ‘ de lichid). Acest lucru se datorează faptului că absorbanța este proporțională cu lungimea căii, nu cu volumul eșantionului.
în testele de absorbție a microplăcilor, lungimea căii este egală cu adâncimea lichidului și este posibilă miniaturizarea fără pierderea semnalului prin reducerea diametrului puțurilor și menținerea unei adâncimi constante a lichidului. De exemplu, 96 de plăci de puțuri pot găzdui cu ușurință 200ul de probă, dar cu un volum de testare de 50ul ar fi mai bine să folosiți o placă de 384 de puțuri pentru a crește lungimea căii peste cea văzută cu 50ul de probă într-o placă de 96 de puțuri.
teste continue (măsurarea aspectului produsului în timp)
majoritatea testelor sunt efectuate pentru o perioadă fixă de timp (teste punct final) și reacția este oprită prin adăugarea unui reactiv de oprire (de exemplu, acid). Cu toate acestea, în testele continue, aspectul produsului (Mai puțin frecvent consumul de substrat) este înregistrat continuu (de ex. cu ajutorul unui înregistrator de diagrame). Se aplică aceleași reguli de bază; un grafic de semnal versus timp pentru o cantitate fixă de enzimă ar trebui să fie liniar și rata ar trebui să se dubleze dacă cantitatea de enzimă este dublată. Atât timp cât testul este operat în intervalul liniar, activitatea necunoscutelor diluate corespunzător poate fi determinată cu exactitate pe baza ratelor inițiale de reacție măsurate cu un set de standarde.
ce concentrație de substrat ar trebui să folosesc?
concentrația substratului va influența viteza de reacție, dar există mai mulți factori de luat în considerare în selectarea concentrației corecte. Din punct de vedere practic, un aspect cheie este cantitatea de produs care trebuie generată pentru a da un semnal de analiză măsurabil. Deoarece viteza unei reacții enzimatice este probabil să scadă atunci când mai mult de aproximativ 15% din substrat a fost hidrolizat, concentrația inițială a substratului ar trebui să fie, în general, de cel puțin 10 ori concentrația produsului despre care se știe că dă un semnal de analiză acceptabil.
Un alt considerent este Km pentru substrat. În timp ce adăugarea mai multor substraturi înseamnă, în general, că veți vedea valori de activitate mai mari, relația nu este liniară și este posibil să fie necesar să se ia în considerare costul substratului. În acest moment este probabil util să se introducă ecuația clasică Michaelis-Menten:
v = (Vmax S) / (Km + s) ……………. Eqn. (1)
unde v este rata, Vmax este rata maximă posibilă, S este concentrația substratului și Km este egală cu concentrația substratului care dă jumătate din activitatea maximă. Derivarea acestei ecuații și ipotezele sale subiacente pot fi găsite în orice carte de text despre cinetica enzimei. Deși este normal să se măsoare mai degrabă decât să se calculeze rata reacțiilor enzimatice, este util să se înțeleagă principiile de bază în scopul proiectării testului.
ecuația Michaelis-Menten este utilă prin faptul că vă ajută să selectați o concentrație adecvată de substrat dacă Km este cunoscut.
atunci când s=Km, v = (Vmax s)/2S, adică v/Vmax = s / 2S = Ecuador.
cu alte cuvinte, enzima va funcționa la 50% din rata maximă posibilă atunci când s=Km.
înlocuind în ecuația 1 valorile pentru S = 10 și Km = 1 veți vedea că prin creșterea concentrației substratului de 10 ori enzima funcționează acum la ~90% din rata maximă posibilă, în loc de 50%. În mod clar acest lucru este mai mare, dar nu de 10 ori mai mare.
la concentrații foarte mari de substrat, Km în ecuația 1 devine numeric nesemnificativ, iar viteza măsurată este apoi egală cu Vmax.
multe teste sunt efectuate cu concentrația substratului la sau în jurul valorii Km, dar dacă Km este foarte mare, este posibil să nu fie posibilă utilizarea unei concentrații atât de mari de substrat (de ex. din motive de cost sau solubilitate limitată).
în unele situații poate fi chiar recomandabil să se utilizeze o concentrație relativ scăzută de substrat. De exemplu, în descoperirea medicamentelor farmaceutice, utilizarea unei concentrații foarte mari de substrat ar face mai dificilă identificarea inhibitorilor enzimatici competitivi (inhibitorii competitivi se leagă de același SIT ca substratul).
trebuie realizat un echilibru al diferiților factori, astfel încât testul să aibă un semnal măsurabil, să poată fi operat în intervalul liniar și să poată îndeplini orice alte obiective ale testului (de exemplu, cost, timp și așa mai departe).
curbe Standard
o curbă standard este întotdeauna necesară dacă doriți să calculați activitatea enzimei. Nu este esențial dacă sunteți interesat doar de valorile relative ale activității.
curba standard este construită prin măsurarea semnalului de testare cu soluții standard ale produsului de reacție într-un interval adecvat de concentrații. În mod ideal, ar trebui să rulați o curbă standard pentru fiecare experiment, dar dacă curba standard este foarte reproductibilă, poate fi acceptabil să o rulați periodic.
o curbă standard tipică este prezentată în Figura 2 de mai jos. Aceasta este o curbă standard pentru un test ATPază, în care ATP este hidrolizat la ADP și Pi (fosfat anorganic).
Fig 2. Curba Standard pentru Pi
fosfatul este detectat cu ajutorul unui reactiv de legare a colorantului care își schimbă culoarea în prezența fosfatului. Cu toate acestea, specificul acestui test nu este important aici; indiferent de natura produsului sau de metoda de detectare utilizată, trebuie construită o curbă standard care arată dependența semnalului de cantitatea de produs din test. Curba (în mod ideal este o linie dreaptă) este utilizată pentru a determina cantitatea de produs generată în eșantioane cu activitate necunoscută, adică din valoarea absorbanței, prin citirea interceptării pe axa X. (Majoritatea pachetelor software grafice vor calcula automat valorile lui x din valorile măsurate ale lui y). Cantitatea de activitate poate fi apoi calculată (a se vedea mai târziu).
desenez concentrația sau cantitatea absolută pe axa X?
nu există un singur răspuns corect aici, iar posibilitatea utilizării oricărei abordări poate provoca adesea confuzie atunci când se calculează valorile activității. De exemplu, trasarea nmol a produsului pe axa x este foarte convenabilă dacă trebuie să calculați valorile activității (amintiți-vă, activitate = nmol pe minut pe ml). Cu toate acestea, reactivii de laborator sunt de obicei preparați la concentrații cunoscute și este adesea mai ușor să se traseze aceste valori pe axa X. Cu toate acestea, atunci când calculați activitatea (sau activitatea specifică) enzimei dvs., trebuie să vă amintiți să convertiți concentrația pe axa x în numărul de nmoli ai produsului format, ceea ce înseamnă că trebuie să țineți cont de volumul testului. Motivul este ușor de înțeles: Volumele 50ul și 100ul ale unei soluții standard vor fi la aceeași concentrație, dar volumul mai mare va conține de două ori cantitatea de produs. În general, cel mai bine este să alegeți o abordare (adică fie o cantitate absolută de produs, fie o concentrație), astfel încât să se utilizeze întotdeauna aceeași metodă de calcul a activității.
controalele și scăderea datelor necompletate
controalele adecvate sunt de o importanță vitală pentru munca cantitativă, la fel ca și utilizarea corectă a datelor de control în calcule.
controalele vă spun (indirect) cât de mult din semnalul de testare se datorează acțiunii enzimei și cât de mult apare din alte motive. O sursă comună de semnal fals este substratul (care poate fi adesea contaminat cu produsul). Alte componente ale testului pot genera, de asemenea, un semnal mic, în funcție de natura componentelor și de tipul testului. Scopul controalelor este de a vă permite să eliminați (prin scădere) orice elemente ale semnalului total care nu sunt legate de acțiunea enzimei. Dacă testul este bine conceput și reactivii de testare sunt de bună calitate, tratamentul controalelor este de obicei destul de simplu.
câteva linii directoare generale sunt prezentate mai jos:
dacă revenim la testul colorimetric pentru detectarea fosfatului anorganic, putem evidenția unele probleme potențiale care sunt ușor detectate cu controale adecvate.
reactivul de detectare a fosfatului oferă o citire scăzută de aproximativ 0,08 într – o placă de 96 de puțuri la lungimea de undă utilizată pentru măsurare (în jur de 650nm).
am putea configura următoarele teste/controale (citiri între paranteze într-o situație ipotetică de testare):
- toate componentele testului minus enzima (0,5)
- enzimă pe cont propriu (0,1)
- enzimă plus toate celelalte componente (1,8)
în mod clar semnalul testului de 1,8 nu se datorează exclusiv acțiunii enzimei asupra substratului.
pentru orice test enzimatic, un control cheie (A) este să lăsați enzima (și să o înlocuiți cu tampon). Acest lucru vă va oferi semnalul de fundal pentru toate celelalte componente ale testului ca grup, inclusiv substratul care poate conține o cantitate mică de produs. Acest control nu vă spune semnalul de fundal pentru enzimă, dar în mod clar nu puteți adăuga enzima la substrat ca control! În majoritatea testelor, enzima nu dă semnal, deoarece este diluată semnificativ înainte de utilizare în test. Acest lucru poate fi verificat cu ușurință, ca în B de mai sus.
datele pentru proba A (de mai sus) sugerează că amestecul este contaminat cu fosfat anorganic. Componentele individuale pot fi apoi verificate pentru a identifica sursa problemei. Această situație este destul de frecventă pentru testele de Atpaze și alte enzime generatoare de fosfat, deoarece substraturile sunt adesea instabile și sunt parțial hidrolizate pentru a da un anumit fosfat anorganic.
poate fi ciudat să corectăm datele brute dacă mai multe componente dau semnale false; eliminarea problemei la sursă este, în general, mult mai bună decât orice tratament matematic. Valoarea corectată pentru eșantionul C de mai sus poate părea a fi 1.2 (adică. 1.8 – 0.5 – 0.1) dar strict vorbind acest lucru este greșit. Amintiți-vă că placa de testare plus reactivul de detectare dau un semnal de fundal de aproximativ 0,08, astfel încât sursa majorității semnalului pentru controlul A este plasticul plăcii și / sau reactivul de detectare. Același semnal mic trebuie, de asemenea, ascuns în valoarea pentru controlul enzimei. Astfel, în corecția aplicată mai sus am scăzut acest gol ascuns de două ori.
va trebui întotdeauna să scădeți controalele din datele de testare și este de preferat să combinați toate substanțele (cu excepția enzimei) și să scădeți o singură valoare. Dacă se adoptă această abordare, curba standard este tratată în același mod și se scade o valoare de control (adică valoarea obținută în absența produsului, adică analogă cu placa/reactivul martor discutat mai sus). Astfel, nici datele de testare scăzute, nici curba standard scăzută nu conțin semnalul de fundal potențial înșelător cauzat de reactivul placă/test.
în cele din urmă, după cum am văzut, semnalele false sunt ușor de detectat cu controale adecvate, dar cea mai bună strategie pentru a obține date de bună calitate este utilizarea reactivilor cu medii scăzute, astfel încât valorile controalelor să fie scăzute. De asemenea, este util să se genereze un semnal de analiză (datorită enzimei) care este mult mai mare decât orice semnal de fundal. În mod ideal, raportul semnal-fundal ar trebui să fie de cel puțin 5 și, de preferință, 10 sau mai mult pentru o muncă cantitativă precisă.
calcularea valorilor activității
Acest lucru este destul de ușor de înțeles dacă ne-am back-calcula din datele de analiză brute în mod pas-înțelept. De exemplu, să spunem că am generat 10nmol de produs în reacția noastră enzimatică (adică determinată din curba standard a semnalului față de cantitatea absolută de produs). Deoarece activitatea este exprimată ca nmol pe minut pe ml, trebuie să luăm în considerare timpul și volumul și, poate mai puțin evident, cantitatea și diluția enzimei pentru a calcula activitatea.
dacă testul are o lungime de 10 minute, numărul de nmol pe minut din exemplul de mai sus este 1. (pasul 1)
dacă volumul testului este 200ul, trebuie să înmulțim cu 5 (adică 1000/200) pentru a obține nmol pe minut pe ml. (etapa 2)
această valoare se referă la activitatea enzimei în test, nu în proba de enzimă utilizată pentru a configura testul. Sunt necesari câțiva factori suplimentari de corecție pentru a determina activitatea enzimei în eșantionul inițial de enzimă.
este posibil ca enzima să fi fost diluată înainte de utilizare și trebuie diluată suplimentar de celelalte componente prezente în test. Dacă testul (200ul în total) cuprinde 20ul de enzimă, iar enzima este pre-diluată 1/100 înainte de adăugarea probei 20ul, puteți vedea probabil că ar trebui să înmulțim mai întâi cu 10 (Pasul 3) și apoi cu 100 (pasul 4) pentru a obține activitatea enzimei în soluția enzimatică originală.
până acum acest lucru este relativ simplu. Cu toate acestea, am menționat mai devreme că concentrația este adesea reprezentată grafic pe axa x a curbei standard. Astfel, valorile pot fi exprimate în termeni mM (nu mmol) și nu puteți determina numărul de mmol pur și simplu inspectând curba standard.
deoarece mM înseamnă mmoli pe litru, avem o discrepanță între volumul implicit de 1L și volumul real de testare. Astfel, dacă avem produs de 10 mm și volumul testului este de 200ul, trebuie să împărțim la 5000 pentru a obține numărul de mmoli ai produsului.
puteți observa aici că împărțirea la 5000 aici compensează unele dintre operațiile de multiplicare care au fost necesare mai sus. Într-adevăr, este destul de normal ca factorii de corecție să anuleze. De exemplu, într-un test de 10 minute folosind 1/10 enzimă diluată, veți împărți cu 10 pentru a obține nmol pe minut și înmulțiți cu 10 mai târziu pentru a corecta factorul de diluare.
rezultă că dacă utilizați întotdeauna condiții standard de testare (adică. veți putea multiplica valoarea ‘x’ din curba standard cu un singur factor de corecție global, care cuprinde toți ceilalți factori de corecție individuali, pentru a vă calcula valorile activității. Numai cu prima ocazie trebuie să identificați factorii de corecție individuali.
inhibarea enzimei / Screening-ul medicamentului
acesta este un domeniu al enzimologiei în care rămâne nevoie să funcționeze în intervalul liniar, dar în care calculele valorilor activității nu sunt de obicei relevante; mai degrabă, viteza relativă de reacție (sau cantitatea relativă de produs formată) în prezența și absența unei substanțe testate este esențială, ceea ce necesită puțin mai mult decât calcule simple folosind datele de testare scăzute în martor. După scăderea semifabricatelor, cantitatea de produs formată este exprimată ca procent din cantitatea obținută în absența substanței testate (adică 100%). Aceste teste pot fi uneori rulate cu raporturi semnal-fundal destul de scăzute, deoarece se pune întrebarea-substanța testată inhibă reacția?
– necesită doar un răspuns Da / Nu.
rezumat
sperăm că acest ghid a oferit explicații clare privind ‘unitățile enzimatice’, ‘activitatea enzimatică’ și ‘activitatea enzimatică specifică’, precum și definițiile unităților și importanța ‘intervalului liniar’. Specificul a ceea ce se trasează pe axa x a curbelor standard este o chestiune de preferință a utilizatorului, dar este necesară o anumită atenție atunci când se calculează activitățile. Controalele de testare sunt importante, dar utilizarea reactivilor de înaltă calitate este mai bună decât eliminarea fundalurilor folosind abordări matematice. Un raport semnal / fundal ridicat este de dorit pentru munca cantitativă și un număr de parametri pot fi variați pentru a crește semnalul de testare; nu este întotdeauna necesar pur și simplu să adăugați mai multă enzimă. Valorile activității enzimatice pot fi calculate cu ușurință dacă se utilizează o abordare treptată pentru a identifica variabilele cheie de testare.
vezi mai multe protocoale și ghiduri