Introducere
Kcat este cifra de afaceri numărul — numărul de substrat molecula fiecare enzimă site-ul convertește la produs pe unitatea de timp. Dacă cunoașteți concentrația siturilor enzimatice, puteți potrivi Kcat în loc de Vmax atunci când analizați un substrat vs.curba vitezei.
modelul
Y = Et*kcat*X/(Km + X)
X este concentrația substratului.
Y este viteza enzimei.
kcat este numărul cifrei de afaceri, de câte ori fiecare situs enzimatic convertește substratul în produs pe unitate de timp. Aceasta este exprimată în inversul unităților de timp ale axei Y. De exemplu, dacă Y este în micromoli de substrat pe minut, atunci kcat este numărul de molecule de substrat produse pe situs catalitic pe minut.
Km este Constanta Michaelis-Menten, în aceleași unități ca X. este concentrația substratului necesară pentru a atinge o viteză enzimatică pe jumătate maximă.
Et este concentrația situsurilor catalitice enzimatice. Dacă enzima are mai multe subunități, rețineți că Et este concentrația siturilor catalitice, care poate fi mai mare decât concentrația moleculelor enzimatice. Valorile Y pe care le introduceți sunt viteza enzimei introduse în unități de concentrație pe timp. Et trebuie introdus în aceleași unități de concentrație (în timp ce unitățile de timp sunt definite de kcat).
Vmax este viteza maximă a enzimei în aceleași unități ca Y. nu este prezentată direct în modelul de mai sus. Este viteza enzimei extrapolate la concentrații foarte mari de substrat, deci este aproape întotdeauna mai mare decât orice viteză măsurată în experimentul dvs. Se calculează prin înmulțirea et ori kcat.
relația cu modelul Michaelis-Menten
curba prezentată mai sus este identică cu curba definită de modelul Michaelis-Menten. Veți obține curbe identice atunci când potriviți fie modelul la datele dvs., și valori identice pentru Km.
modelul Michaelis-Menten găsește Vmax, care este viteza maximă a enzimei extrapolată la concentrații foarte mari de substrat. Se exprimă în aceleași unități pe care le-ați folosit pentru a introduce valorile Y (activitatea enzimei). De obicei, este simplu să exprimați acest lucru (sau să convertiți la ) moli/minut/mg de proteine. Vmax este determinat de numărul de situsuri enzimatice prezente (Et) și de viteza cu care enzima poate converti substratul în produs (kcat).
dacă cunoașteți concentrația de situsuri enzimatice pe care le-ați adăugat la test (Et), atunci puteți încadra Constanta catalitică Kcat folosind modelul de mai sus.
când se calculează Kcat, unitățile de concentrație se anulează, deci Kcat este exprimat în unități de timp invers. Este numărul cifrei de afaceri-numărul moleculei de substrat pe care fiecare situs enzimatic îl convertește în produs pe unitate de timp.
montarea modelului cu Prisma
1.Creați un tabel de date XY. Introduceți concentrația substratului în X și viteza enzimei în Y. Dacă aveți mai multe condiții experimentale, plasați prima în coloana a, a doua în coloana B etc. De asemenea, puteți alege datele eșantionului Prism: cinetica enzimatică-Michaelis-Menten.
2.După introducerea datelor, Faceți clic pe analiză, alegeți regresie neliniară, alegeți Panoul de ecuații cinetice enzimatice și alegeți Kcat.
3.Trebuie să constrângă Et la o valoare constantă, pe baza altor experimente. Pentru a constrânge valoarea Et, accesați fila constrângere a dialogului de regresie neliniară, asigurați-vă că meniul derulant de lângă Et este setat la „Constant egal cu” și introduceți valoarea. Pentru datele eșantion, introduceți 100 ca valoare a Et.
dacă nu știți valoarea Et, nu se poate potrivi kcat, dar în schimb ar trebui să se potrivească Vmax. Nu este posibil ca Prism să se potrivească atât cu kcat, cât și cu Et, deoarece cei doi parametri sunt împletiți, iar o curbă substrat-viteză nu oferă informații despre valorile lor individuale.
4.Cu datele eșantionului, Prism raportează că Km = 5.886 cu un interval de încredere de 95% cuprins între 3.933 și 7.839. Cea mai bună valoare de potrivire a kcat este de 13,53, cu un interval de încredere de 95% cuprins între 11,97 și 15,09.
Note
•a se vedea lista ipotezelor tuturor analizelor cineticii enzimatice.
•această ecuație se potrivește exact aceeași curbă ca ecuația care se potrivește Vmax, mai degrabă decât cifra de afaceri numărul Kcat. Produsul kcat times Et (concentrația situsurilor enzimatice) este egal cu Vmax.
•această ecuație este legată de ecuația pentru enzimele alosterice. Acel model alosteric adaugă un parametru suplimentar: panta de deal h. Când h este egal cu 1,0, cele două modele sunt identice.