high performance liquid cromatography spectrometria de masă este o tehnică instrumentală extrem de versatilă ale cărei rădăcini se află în aplicarea cromatografiei lichide mai tradiționale la teorii și instrumente care au fost inițial dezvoltate pentru cromatografia de gaze (GC). După cum sugerează și numele, instrumentația cuprinde un cromatograf lichid de înaltă performanță (HPLC) atașat, printr-o interfață adecvată, la un spectrometru de masă (MS). Avantajul principal pe care HPLC/MS îl are față de GC/MS este că este capabil să analizeze o gamă mult mai largă de componente. Compușii care sunt labili termic, prezintă polaritate ridicată sau au o masă moleculară mare pot fi analizați cu ajutorul HPLC/MS, chiar și proteinele pot fi analizate în mod obișnuit. Soluțiile derivate din eșantioane de interes sunt injectate pe o coloană HPLC care cuprinde un tub îngust din oțel inoxidabil (de obicei 150 mm lungime și 2 mm Diametru interior sau mai mic) ambalat cu particule fine de silice modificate chimic. Compușii sunt separați pe baza interacțiunii lor relative cu acoperirea chimică a acestor particule (faza staționară) și solventul care eluează prin coloană (faza mobilă). Componentele care se eluează din coloana cromatografică sunt apoi introduse în spectrometrul de masă printr-o interfață specializată. Cele mai comune două interfețe utilizate pentru HPLC/MS sunt ionizarea electrospray și interfețele de ionizare chimică sub presiune atmosferică.
ionizarea cu Electrospray
în ionizarea cu electrospray, analitul este introdus în sursă la debite de obicei de ordinul a 1 ecql min-1. Fluxul de soluție de analit trece prin acul electrospray care are o diferență de potențial mare (în raport cu contra electrodul) aplicat acestuia (de obicei în intervalul de la 2,5 la 4 kV). Acest lucru forțează pulverizarea picăturilor încărcate de pe ac cu o încărcare de suprafață de aceeași polaritate la încărcarea de pe ac. Picăturile sunt respinse din AC spre conul de eșantionare sursă de pe contraelectrod (prezentat în albastru). Pe măsură ce picăturile traversează spațiul dintre vârful acului și Con, are loc evaporarea solventului. Acesta este înconjurat pe Fig.1 și mărită în Fig.2. Pe măsură ce se produce evaporarea solventului, picătura se micșorează până ajunge la punctul în care tensiunea superficială nu mai poate susține sarcina (limita Rayleigh) moment în care apare o „explozie Coulombică” și picătura este ruptă. Aceasta produce picături mai mici care pot repeta procesul, precum și molecule de analit încărcate goale. Aceste molecule de analit încărcate (nu sunt strict ioni) pot fi încărcate individual sau Multiplicate. Aceasta este o metodă foarte moale de ionizare, deoarece foarte puțină energie reziduală este reținută de analit la ionizare. Este generarea de molecule încărcate multiplu care permite analiza componentelor cu greutate moleculară mare, cum ar fi proteinele, deoarece gama de masă a spectrometrului de masă este mult crescută, deoarece măsoară de fapt raportul masă / încărcare, mai degrabă decât masa în sine. Dezavantajul major al tehnicii este că se produce o fragmentare foarte mică (de obicei nu), deși acest lucru poate fi depășit prin utilizarea tehnicilor spectrometrice de masă tandem, cum ar fi MS/MS sau MSn.
Figura 1 o schemă a unei interfețe ESI
Figura 2 o schemă a mecanismului de formare a ionilor
Presiunea atmosferică ionizare chimică
Presiunea atmosferică chimică ionizarea (APCI) este o metodă de ionizare analogă cu ionizarea chimică (ci). Diferența semnificativă este că APCI apare la presiunea atmosferică și are aplicațiile sale primare în zonele de ionizare a compușilor cu masă mică (APCI nu este potrivit pentru analiza compușilor labili termic). Configurarea generală a sursei (vezi Fig. 3) împărtășește o asemănare puternică cu ESI. În cazul în care APCI diferă de ESI, este în modul în care are loc ionizarea. În ESI, ionizarea este cumpărată prin diferența de potențial dintre acul de pulverizare și con, împreună cu desolvarea rapidă, dar blândă. În APCI, soluția de analit este introdusă într-un nebulizator pneumatic și desolvată într-un tub de cuarț încălzit înainte de a interacționa cu descărcarea coroanei creând ioni. Descărcarea corona înlocuiește filamentul de electroni în CI – presiunea atmosferică ar „arde” rapid orice filamente-și produce primar N2+ și N4+ + prin ionizarea electronilor. Acești ioni primari se ciocnesc cu moleculele de solvent vaporizate pentru a forma ioni de gaz reactanți secundari – de ex. H3O + și (H2O)nH+ (vezi Fig. 4). Acești ioni de gaz reactanți suferă apoi coliziuni repetate cu analitul, rezultând formarea ionilor de analit. Frecvența ridicată a coliziunilor are ca rezultat o eficiență ridicată de ionizare și termalizare a ionilor de analit. Acest lucru are ca rezultat spectre de specii predominant moleculare și ioni de aduct cu foarte puțină fragmentare. Odată ce ionii sunt formați, aceștia intră în stadiul de pompare și focalizare în același mod ca și ESI.
Figura 3 o schemă a componentelor unei surse APCI
Figura 4 o vizualizare mai detaliată a mecanismului APCI
diagrame și text (parțial) de Dr. Paul Gates, școala de Chimie, Universitatea din Bristol