apariția biologiei aerobe a fost anunțată acum aproximativ două miliarde de ani, când cianobacteriile primitive au evoluat capacitatea de a fotooxidiza apa. Oxigenul a fost eliberat ca produs rezidual, iar nivelurile atmosferice de O2 au crescut rapid. Această schimbare rapidă într-o atmosferă oxigenică a introdus un poluant devastator, dar în cele din urmă au evoluat organisme care au valorificat forța motrice puternică pentru reducerea O2. Siturile active enzimatice care erau capabile să lege și să activeze oxigenul au evoluat și au devenit posibile noi clase de biochimie care folosesc O2 ca chiuvetă termodinamică pentru a conduce reacții altfel nefavorabile. Eficiența metabolismului alimentar sa schimbat dramatic. Cantitatea de ATP care ar putea fi produsă prin metabolizarea aerobică a glucozei, de exemplu, a crescut de aproape 20 de ori. Eucariotele au apărut la scurt timp după atmosfera oxigenică și au fost în cele din urmă urmate de gama diversă de organisme multicelulare care există astăzi. În biochimia noastră aerobă, O2 este utilizat într-o multitudine de reacții sintetice care sunt fundamentale pentru aproape toate aspectele creșterii, dezvoltării și reproducerii celulare.
în ciuda versatilității sale biochimice, totuși, >95% din oxigenul pe care îl consumăm este utilizat în respirație. Electronii de mare energie derivați din alimente traversează lanțul de transport al electronilor mitocondriali într-o serie de reacții redox exergonice. Aceste transferuri energetice de electroni în jos sunt utilizate pentru a dezvolta gradientul de protoni chimisosmotici care produce în cele din urmă ATP. Oxigenul este ultimul acceptor de electroni din această cascadă respiratorie, iar reducerea sa la apă este utilizată ca vehicul prin care se curăță lanțul mitocondrial de electroni cheltuiți cu energie redusă. Enzima care catalizează acest proces, citocrom oxidaza, se întinde pe membrana mitocondrială. Se leagă, activează și reduce până la 250 de molecule de O2 pe secundă și cuplează energia eliberată în acest proces la translocarea protonilor care contribuie la gradientul chimiosmotic. Mecanismul prin care citocrom oxidaza catalizează această chimie remarcabilă a fost studiat intens. Rezultatele raportate în acest număr de Fabian, Wong, Gennis și Palmer oferă o nouă perspectivă asupra acestui proces și susțin noțiunea tot mai mare că există concepte unificatoare pentru modul în care enzimele care utilizează oxigen activează O2 pentru o XQQ o clivaj și reducere a legăturii (1).
reducerea O2 în citocrom oxidază are loc sub constrângeri severe. Procesul are loc cu puțin suprapotențial, eliberarea intermediarilor de oxigen parțial redus, toxic din situl activ este minimizată, iar energia liberă disponibilă în reducerea O2 este cuplată cu o eficiență ridicată la translocarea protonilor (2, 3). Enzima funcționează sub aceste constrângeri folosind un heme Fe, numit heme A3, și un ion de cupru, denumit CuB, într-un centru binuclear în care O2 se leagă și este redus (vezi Fig. Fig.1).1). Intrarea electronilor în acest sit are loc din citocromul c prin intermediul unui al doilea fier hem, hem a, și un al doilea centru de cupru, CuA. Recent, grupul lui Yoshikawa (4) și grupul lui Michel (5) au furnizat în mod independent și simultan structuri cristaline ale enzimei care au oferit o perspectivă profundă asupra multor aspecte ale ciclului catalitic, în special a modului în care protonii și oxigenul sunt susceptibili să se deplaseze prin proteină. Mecanismul reducerii O2 de către oxidază a fost urmărit de un număr de grupuri cu o varietate de tehnici spectroscopice (pentru RECENZII, Vezi refs. 6 și 7). Din această lucrare, o secvență de reacție simplificată care implică intermediari tranzitori, dar detectabili, la Centrul binuclear poate fi scrisă după cum urmează (Vezi și Fig. Fig.2): 2):
speciile P și F, în special, au atras atenția, deoarece au fost implicate în mecanismul de pompare care conduce translocarea protonilor (8). Lucrările recente ale lui Michel (9) și ale Wikstrului și ale colegilor (10) au evidențiat atât progresul, cât și incertitudinile în înțelegerea mecanismului pe care îl cuplează transferurile de electroni exergonici la oxigen cu mișcarea protonului endergonic peste membrană.
Centrul binuclear în citocrom oxidază. Heme a3 și CuB sunt prezentate împreună cu ligandul proximal pentru fierul hem, H376 și ligandul CuB, H240, care este reticulat cu Y244 (24, 25). O2 legarea și reducerea are loc în regiunea dintre fierul a3 și CuB.
o schemă simplificată pentru reacția dintre citocrom oxidază și O2. Site-ul binuclear, care conține heme A3, CuB și structura reticulată, H240 – Y244 (H-Y), este prezentat. Reducerea și protonarea formei oxidate a Centrului produce site-ul redus. Aceasta leagă O2 pentru a forma inițial specia oxi, care reacționează în continuare pentru a produce intermediari P și F, înainte de a regenera forma oxidată a enzimei. Reducerea P și F sunt limitate de reacțiile de transfer de protoni, așa cum este indicat. Pașii dintre P și forma redusă a sitului au fost implicați în procesele de pompare a protonilor, care sunt indicate prin săgeți roșii. Stoichiometria acestor pași este o chestiune de investigație actuală, deși până la patru protoni pot fi pompați în timpul ciclului complet.
o problemă continuă în dezlegarea chimiei oxigenului la Centrul binuclear din citocrom oxidază și legătura sa cu pompa de protoni este stabilirea structurilor moleculare ale intermediarilor în schema de mai sus. Există un consens că intermediarul F implică un intermediar feril-oxo la heme A3, A34 + o (3, 6, 11, 12), dar structura lui P a fost o chestiune de controverse considerabile. Atribuțiile inițiale ale acestei specii au postulat că aceasta conținea o legătură intactă, a33+—O2 specii de la sută, de unde și denumirea sa Ca P pentru „peroxi” (de exemplu, refs. 3, 8 și 13). Cu toate acestea, Weng și Baker și-au interpretat datele optice pentru a indica faptul că o clivajul legăturii O a avut loc deja la P și că această specie, de asemenea, avea o structură A34+o la centrul binuclear (14). Această concluzie a fost susținută ulterior de mai multe investigații spectroscopice (15-17). Kitagawa, Proshlyakov și colegii lor au reușit să utilizeze spectroscopia Raman pentru a detecta mișcarea de întindere A34 + o (18, 19) într-o formă de P generată prin adăugarea de peroxid la enzima oxidată. Lucrările ulterioare au arătat că aceeași vibrație ar putea fi observată atunci când oxigenul este adăugat la o formă redusă cu doi electroni a enzimei, confirmând că chimia oxigenului și chimia peroxidului din oxidază se desfășoară prin intermediari comuni (20). Mai mult, cursul de timp al apariției lui P în această lucrare a arătat că această specie este competentă din punct de vedere cinetic (vezi și refs. 21 și 22). Astfel, din lucrarea spectroscopică și din lucrările computaționale recente (23), punctul de vedere emergent este că P este într-adevăr o o o specie clivată de legătură.
lucrarea raportată de Fabian și colab. (1) oferă dovezi noi, independente și convingătoare că legătura O-O este scindată în citocrom oxidază la nivelul P. În experimentele lor, ei au argumentat că nici un atom de oxigen într-o structură peroxi intactă de legătură nu este probabil să facă schimb cu apa solventă. Dacă P apare ca specie A34 + o, atunci se așteaptă ca al doilea atom de oxigen să fie probabil la nivelul hidroxidului sau al apei și că acest oxigen se poate schimba bine cu apa din tamponul apos. Folosind 18o2 ca substrat într-un tampon apos care conținea H216O, au prins intermediarul P și au testat apariția H218O. Rezultatele lor spectrometrice de masă arată clar că un singur atom de oxigen din substratul 18O2 este schimbabil cu apă solventă, în acord excelent cu analiza lor de mai sus și cu atribuirea P ca specie feril-oxo clivată de legătură.
realizarea faptului că P are o structură A34+o are o serie de implicații importante. Transformarea O2 legată în specia oxi în hidroxid (sau apă) și un feril-oxo în P necesită un total de patru electroni. Cu toate acestea, doar trei sunt ușor disponibile în centrul binuclear—două de la heme A3 pe măsură ce trece de la +2 la +4 starea de valență și una de la CuB, deoarece este oxidată de la cupros la cupric. Sursa celui de-al patrulea electron este neclară. Oxidarea macrociclului hem, așa cum se întâmplă în compușii I în unele peroxidaze, poate fi eliminată pe baza datelor Raman și optice (6, 7), iar Cu3+ nu a fost detectat în mediul biologic. Candidatul cel mai probabil, atunci, este un lanț lateral proteic activ redox, așa cum se întâmplă în peroxidaza citocromului c, în care triptofanul este redox activ sau în prostaglandina sintază, care conține un reziduu de tirozină oxidabil (24). Yoshikawa și colegii (25) au furnizat dovezi cristalografice izbitoare care susțin cu tărie apariția unui lanț lateral activ redox. Ei au arătat că Y244 în centrul binuclear este reticulat cu unul dintre liganzii CuB, H240, și că grupul capului fenol este orientat astfel încât grupul −OH să indice direct în cavitatea de legare a O2 (Fig. (Fig.1).1). Michel a raportat date cristalografice similare (26), iar Buse și colegii au raportat recent date biochimice care susțin apariția legăturii încrucișate H240-Y244 (27). De asemenea, au fost raportate date recente despre EPR care indică prezența radicalilor tirozilici atunci când peroxidul este adăugat la enzima de repaus, deși lanțul(lanțurile) lateral (e) specifice implicate nu au fost identificate (28, 29). Luate împreună, aceste rezultate sugerează cu tărie că tirozina reticulată este sursa celui de-al patrulea electron în activarea și reducerea O2 de către citocrom oxidază. Această presupunere duce la ciclul de reacție simplificat din Fig. Fig.2,2, în care structura h-y reticulată este prezentată în mod explicit și propusă a fi oxidată la radicalul tirozil neutru în intermediarul P.
schema din Fig. Fig.22 evidențiază analogiile dintre citocrom oxidază și peroxidaze și catalaze în ceea ce privește chimia de clivaj a legăturii oxigen–oxigen și în ceea ce privește produsele care rezultă din reacție. În oxidază, enzima extrage trei electroni din metalele din situsul activ și un al patrulea electron dintr—o parte organică pentru a reduce O2 într-o singură etapă la o si oh -. Ambele produse sunt la nivelul apei, deși protonarea și eliberarea ulterioară apar doar în etapele ulterioare ale reacției. În peroxidaze și catalaze, enzima extrage un electron dintr—un metal din situsul activ și un al doilea electron dintr-o parte organică pentru a reduce H2O2 într-o singură etapă la o si oh -. În peroxidaze și catalaze, produsul imediat al acestei chimii este compusul I, care conține o specie feril-oxo și un radical organic. Aceste structuri sunt exact analoge cu structura A34 + o/radical a lui A34 + care apare în P în citocrom oxidază. Radicalul organic din compusul I este redus într-o etapă ulterioară în enzimele peroxidază și catalază pentru a produce compusul II, care menține structura feril-oxo. În oxidază, aceeași chimie are loc pentru a produce intermediarul F. Similitudinea în chimie a proteinelor heme care metabolizează oxigenul a apărut doar odată cu realizarea structurii A34+o pentru P și sugerează că alte enzime care metabolizează oxigenul pot urma același tip de chimie în activarea și reducerea oxigenului și a peroxizilor.
o strategie interesantă apare din Fig. Fig.22 în ceea ce privește modul în care oxidaza cuplează chimia oxigenului la pompa de protoni. Etapele de pompare apar numai după formarea P (8-10), ceea ce înseamnă că enzima activează mai întâi și reduce O2 la molecule de apă produse complet reduse, dar incomplet protonate; enzima completează transferul de electroni cu patru electroni în oxigen și stochează energia liberă care rezultă ca fiind extrem de oxidantă A34+o o și specii radicale, înainte de a angaja pompa. Calculele recente privind chimia clivajului bond susțin această idee, deoarece rezultatele indică faptul că reducerea O2 la oxo și hidroxo cu formarea unui radical și a unui feril-oxo este aproape de termoneutral (23). Aceasta reprezintă o strategie remarcabil de eficientă pentru evitarea speciilor toxice, parțial reduse de oxigen, deoarece niciuna nu apare în ciclul de reacție. Mai mult, prin transferul energiei libere care va fi utilizată pentru a conduce pompa de la produsele de oxigen substate la proteină, se pare că oxidaza a maximizat controlul și eficiența cu care poate opera aparatul de translocare a protonilor.