consilierul dvs. vă spune că dorește să utilizați HPLC pentru a analiza compusul. Știți că ați auzit de această tehnică înainte, dar nu vă puteți aminti ce înseamnă HPLC, darămite cum să faceți acest lucru! Am fost cu toții acolo și pun pariu că ți-ai fi dorit să fi acordat mai multă atenție la acea prelegere!
nu vă temeți – în această serie de articole vă voi reaminti despre puterea coloanei HPLC
în acest prim articol, vă voi duce prin principiul din spatele HPLC și vă voi aminti de utilizările sale – veți fi gata pentru laborator în cel mai scurt timp!
cum funcționează HPLC?
cromatografia lichidă de înaltă performanță, sau HPLC, este un nume lung pentru o tehnică puternică bazată pe simplul fapt că compușii individuali se comportă diferit în apă.
HPLC separă și purifică compușii în funcție de polaritatea lor, sau tendința lor de a place sau displace apa. Pentru a pune polaritatea în context, considerați că uleiul este un lichid apolar care nu se amestecă cu apa. Etanolul, pe de altă parte, este polar și, după cum mulți dintre voi știți, se amestecă foarte bine cu apa (Vodka și cocs oricine??).
am încercat să simplific întregul proces în Figura 1 de mai jos, dar mai întâi să ne uităm la principalele componente implicate în HPLC. Scuze în avans pentru un jargon inevitabil!
componentele
coloana HPLC
aceasta este cunoscută și sub denumirea de fază staționară. Acesta este calul de lucru al mașinii HPLC, este fabricat dintr-o varietate de substanțe (adesea silice) și este foarte compact în natură. Particulele de silice sunt funcționalizate prin lanțuri lungi de carbon. Lanțurile de carbon sunt apolare și, prin urmare, cu cât lanțul este mai lung, cu atât coloana devine mai apolară. Coloanele care conțin lanțuri de 18 carbon sunt utilizate în mod obișnuit și sunt cunoscute sub numele de coloane C18.
eșantionul HPLC
tipurile de eșantioane variază foarte mult în funcție de câmp și de tipul de compuși în cauză. HPLC poate fi utilizat pentru a analiza compușii din specimene biologice (urină, sânge, salivă și mușchi), probe de mediu, chimie medicamentoasă (medicamente) și microbiologie (toxine produse de ciuperci și bacterii).
injectarea eșantionului
probele sunt injectate în coloana HPLC. Acest lucru se făcea manual, ceea ce înseamnă că un suflet sărac trebuia să stea lângă mașina HPLC ore întregi injectând fiecare probă cu o seringă, uneori toată noaptea!
Din fericire, modelele mai noi au un injector automat, reducând intrarea manuală și permițând un debit mai mare. Mașinile moderne sunt echipate cu software care permite utilizatorului să introducă o listă de eșantioane, cât și în ce ordine ar trebui injectate. Deci, vă puteți bucura de masa de prânz în timp ce HPLC se execută!
faza mobilă
acesta este într-adevăr doar un amestec de apă și un solvent organic (de obicei acetonitril sau metanol). Faza mobilă primește numele deoarece se deplasează prin coloană și, în același timp, eluează (sau elimină) compușii din coloană.
compușii sunt adesea eluați de-a lungul unui gradient de concentrație. Dacă sunteți ceva ca mine, concentrare și gradient sunt două cuvinte pe care le urăsc pentru a vedea venind împreună într-o propoziție! Înseamnă doar că procentul de apă din faza mobilă scade în timp, în timp ce procentul solventului apolar crește simultan. Aceasta înseamnă că faza mobilă devine treptat mai apolară. Nu vă faceți griji prea mult despre gradienți deocamdată, deoarece acestea vor apărea din nou într-un articol de urmărire.
rularea HPLC
HPLC poate fi efectuată în mai multe moduri. Metoda cea mai frecvent utilizată este cunoscută sub numele de faza inversată (RP-HPLC) și aceasta este ceea ce descriu aici. În acest mod, compușii sunt separați începând cu cei mai polari și terminând cu compușii apolari. Pentru toate modurile, o pompă de mare putere deplasează proba și faza mobilă prin coloană. O alergare tipică poate dura între 10-60 de minute.
principiul din spatele HPLC – o privire mai atentă
acum, că aveți o idee despre componentele implicate, să trecem la principiul într-un pic mai detaliat.
am menționat mai sus că HPLC separă compușii pe baza polarității. Dar cum funcționează de fapt acest lucru? Engleză vă rog! Pe măsură ce gradientul intră, concentrația solventului crește în timp ce concentrația apei scade. Acest lucru face ca faza mobilă să fie din ce în ce mai apolară. Compușii conținuți în eșantion se vor lipi de lanțurile de carbon din coloană, cei mai mulți compuși apolari lipind cei mai puternici, iar cei mai polari compuși lipind slab.
Figura 1 arată ce se întâmplă cu o probă care conține un amestec de compuși după injectarea în coloană. Compușii se leagă de coloană și sunt spălați în momente diferite, în funcție de faptul dacă sunt mai predispuși să se lipească de coloană sau de faza mobilă pe măsură ce este pompată. Timpul în care fiecare compus eluează (sau se scurge) din coloană este cunoscut sub numele de timpul de retenție al compusului (Rf).
Figura 1: Principiul din spatele HPLC
Figura 1: compuși de polarități diferite (indicați ca nuanțe întunecate de albastru) sunt injectați în coloana HPLC (întregul cilindru). Faza mobilă este pompată prin coloană, iar adăugarea solventului de-a lungul unui gradient de concentrație (prezentat ca o linie punctată neagră) scade continuu polaritatea generală a fazei mobile (axa Y). Compușii sunt capabili să se lipească fie de coloană, fie de faza mobilă, în funcție de cât de polari sunt. Compușii se vor lipi în cele din urmă de faza mobilă atunci când polaritatea lor se potrivește cu cea a fazei mobile. Apoi se vor disocia de coloană și vor fi eluate la un anumit moment (axa X) în timpul rulării. Acest timp este cunoscut sub numele de Rf pentru acel compus.
înțelegerea ieșirii
ieșirea sau rezultatele unei rulări HPLC sunt de obicei privite ca o cromatogramă (Figura 2). Aceasta este o serie orizontală de vârfuri reprezentând compuși eluați din coloană cu valori Rf diferite. Echipamentele moderne HPLC sunt adesea cuplate la un detector de matrice de diode (DAD), permițând utilizatorului să privească cromatograma rezultată a compușilor separați în lungimi de undă de la 190 nm la 900 nm. Dacă compușii investigați sunt cunoscuți, utilizatorul poate alege să privească doar 1 sau câteva lungimi de undă selectate. De exemplu, cocaina poate fi observată la 254 nm.
Figura 2: o cromatogramă tipică HPLC
Figura 2: Această cromatogramă arată separarea compușilor de o reacție chimică, iar cromatograma este vizualizată la 254 nm. Două vârfuri principale apar la 8,20 și 9 minute, reprezentând doi compuși cu acești timpi de retenție. Numărul de unități de absorbție (AU) este afișat pe axa Y, în timp ce timpul de rulare este afișat pe axa X.
Aplicații
în biologie și medicină, HPLC este adesea folosit ca instrument analitic pentru a testa probe biologice și de mediu pentru prezența sau absența compușilor cunoscuți (de exemplu metaboliți, medicamente, toxine, pesticide) și poate ajuta la identificarea compușilor necunoscuți.cu toate acestea, în chimie, HPLC este utilizat în mod obișnuit pentru a monitoriza reacțiile chimice, precum și pentru a determina puritatea produselor. În plus, procesul de HPLC poate fi modificat la HPLC preparativ, prin care compușii de interes pot fi purificați pentru utilizare ulterioară.
HPLC poate veni peste ca fiind foarte complicat pentru a începe cu, dar fiți siguri, la fel ca cele mai multe alte tehnici de laborator, are mult mai mult sens atunci când o faci de fapt.
rămâneți la curent cu articolele mele de urmărire din săptămânile următoare, în care voi trece prin câteva indicii despre cum puteți obține cele mai bune rezultate din alergarea HPLC în funcție de obiectivul dvs. de cercetare, precum și despre modul în care HPLC poate fi utilizat în cadrul cercetării dvs.
există alte aspecte ale acestei tehnici pe care doriți să le acoperiți mai detaliat? Dacă da, ne-ar plăcea să auzim de la tine!
fericit HPLC-ing
te-a ajutat asta? Apoi, vă rugăm să partajați cu rețeaua.