En la década de 1970, la mayoría de la cromatografía líquida se realizó utilizando una fase estacionaria de soporte sólido (también llamada columna) que contenía resinas de sílice o alúmina sin modificar. Este tipo de técnica se conoce ahora como cromatografía de fase normal. Dado que la fase estacionaria es hidrofílica en esta técnica, las moléculas con propiedades hidrofílicas contenidas dentro de la fase móvil tendrán una alta afinidad por la fase estacionaria, y por lo tanto se adsorberán al embalaje de la columna. Las moléculas hidrofóbicas experimentan menos afinidad por el embalaje de la columna, y pasarán para ser eluidas y detectadas primero. La elución de las moléculas hidrofílicas adsorbidas al embalaje de la columna requiere el uso de disolventes más hidrofílicos o más polares en la fase móvil para desplazar la distribución de las partículas en la fase estacionaria hacia la de la fase móvil.
La cromatografía de fase inversa es una técnica que utiliza cadenas de alquilo unidas covalentemente a las partículas de fase estacionaria para crear una fase estacionaria hidrofóbica, que tiene una afinidad más fuerte por compuestos hidrofóbicos o menos polares. El uso de una fase estacionaria hidrofóbica es esencialmente el reverso de la cromatografía de fase normal, ya que la polaridad de las fases móvil y estacionaria se han invertido, de ahí el término cromatografía de fase inversa. La cromatografía de fase inversa emplea una fase móvil polar (acuosa). Como resultado, las moléculas hidrofóbicas en la fase móvil polar tienden a adsorberse a la fase estacionaria hidrofóbica, y las moléculas hidrofílicas en la fase móvil pasarán a través de la columna y se eluirán primero. Las moléculas hidrofóbicas se pueden eluir de la columna disminuyendo la polaridad de la fase móvil utilizando un solvente orgánico (no polar), que reduce las interacciones hidrofóbicas. Cuanto más hidrofóbica sea la molécula, más fuerte se unirá a la fase estacionaria y mayor será la concentración de disolvente orgánico que se requerirá para eluir la molécula.
Muchas de las consideraciones matemáticas y experimentales utilizadas en otros métodos cromatográficos también se aplican a RPC (por ejemplo, la resolución de separación depende de la longitud de la columna). Se puede utilizar para la separación de una amplia variedad de moléculas. No se utiliza típicamente para la separación de proteínas, porque los disolventes orgánicos utilizados en RPC pueden desnaturalizar muchas proteínas. Por esta razón, la cromatografía de fase normal se usa más comúnmente para la separación de proteínas. Sin embargo, la desnaturalización de las proteínas en realidad puede ser beneficiosa en el análisis posterior de las muestras obtenidas de la cromatografía. Si se realiza una digestión enzimática con tripsina en las proteínas analizadas, la proteína linealizada es más adecuada para ello. Por lo tanto, la desnaturalización de proteínas utilizando disolventes apropiados que causan el despliegue de las proteínas puede ser intencional antes de tomar la muestra fraccionada a través de espectrometría de masas.
Hoy en día, el CPR es una técnica analítica de uso frecuente. Hay una variedad de fases estacionarias disponibles para su uso en RPC, lo que permite una gran flexibilidad en el desarrollo de métodos de separación.
Fases estacionarias a base de sílicaeditar
Cualquier sustancia polar inerte que logre un embalaje suficiente se puede utilizar para cromatografía de fase inversa. La columna más popular es una sílice unida por cadena de carbono octadecilo (C18) (clasificación USP L1). A esto le siguen la sílice unida a C8 (L7), la sílice pura (L3), la sílice unida a ciano (L10) y la sílice unida a fenilo (L11). Tenga en cuenta que C18, C8 y fenilo son resinas dedicadas de fase inversa, mientras que las columnas ciano se pueden usar en modo de fase inversa dependiendo de las condiciones de analito y fase móvil. No todas las columnas C18 tienen propiedades de retención idénticas. La funcionalización superficial de la sílice se puede realizar en una reacción monomérica o polimérica con diferentes organosilanos de cadena corta utilizados en un segundo paso para cubrir los grupos de silanol restantes (tapado final). Si bien el mecanismo de retención general sigue siendo el mismo, las diferencias sutiles en la química superficial de las diferentes fases estacionarias conducirán a cambios en la selectividad.
Las columnas modernas tienen una polaridad diferente. La PFP es pentafluorfenilo. CN es ciano. NH2 es amino. El SAO es octadecilo o C18. ODCN es una columna de modo mixto compuesta por C18 y nitrilo. SCX es un fuerte intercambio catiónico (utilizado para la separación de aminas orgánicas). SAX es un intercambio aniónico fuerte (utilizado para la separación de compuestos de ácido carboxílico).