Efecto del colesterol en la estructura de una bicapa fosfolípida

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• biomembrana
• simulación molecular
• comportamiento de fase
• dimiristoilfosfatidilcolina
• modelo mesoscópico

En este artículo abordamos una pregunta termodinámica aparentemente simple: ¿cómo cambia el área por molécula de una membrana fosfolípida si agregamos colesterol? Esta pregunta fue planteada por primera vez por Leathes (1) en 1925 y todavía se discute hoy en día. El significado de esta pregunta se relaciona directamente con la importancia del colesterol para el funcionamiento de las membranas de los eucariotas superiores. Por ejemplo, el colesterol regula la fluidez de la membrana y modula la función de las proteínas de membrana (2). La comprensión de estos mecanismos ha motivado a muchos investigadores a investigar las interacciones de lípidos y colesterol en detalle. Debido a que una membrana se puede ver como un líquido 2D, una primera estimación de cómo cambiaría el área por molécula al agregar colesterol sería asumir la mezcla ideal, donde el área por molécula es simplemente un promedio ponderado de las áreas de componentes puros. En 1925, las pieles mostraron que, en lugar de la mezcla ideal, se observa un comportamiento no ideal sorprendente (1). Este comportamiento no ideal se denomina efecto condensador (3) porque el área por molécula es mucho menor en comparación con la mezcla ideal. Debido a que una membrana se comporta como un fluido incompresible, una disminución del área por molécula resultará en un aumento significativo correspondiente del grosor total de la bicapa. Tal aumento del grosor indica una reorganización de la estructura de la membrana. Debido a que los cambios en la estructura de la membrana pueden tener consecuencias importantes para el funcionamiento de las proteínas (2), es importante tener una mejor comprensión molecular de los cambios inducidos por el colesterol.

Se han propuesto diferentes modelos conceptuales para explicar las interacciones colesterol–lípidos no ideales. Los ejemplos incluyen el modelo de complejos condensados (4, 5), el modelo de superradio (6) y el modelo paraguas (7). El modelo de complejos condensados explica el efecto de condensación asumiendo que el colesterol induce la formación reversible de un complejo estequiométrico colesterol-lípidos. En un complejo de este tipo, la membrana se condensa a medida que las cadenas de lípidos acil están más ordenadas. A una determinada concentración de colesterol, existe una composición de equilibrio entre estos complejos de colesterol–lípidos condensados y los lípidos ordinarios. El modelo superlattice asume que en concentraciones críticas las moléculas de colesterol exhiben un orden específico de largo alcance. El modelo paraguas adopta el punto de vista de que la parte hidrofílica del colesterol es demasiado pequeña y, por lo tanto, los lípidos deben contribuir a la detección de las moléculas de colesterol de las interacciones hidrofóbicas con el agua. Los fosfolípidos solo pueden crear este paraguas si estas moléculas se enderezan para hacer espacio para el colesterol. En estos modelos, los mecanismos subyacentes que conducen a la condensación son muy diferentes. Curiosamente, un estudio experimental reciente concluyó que sus datos apoyaban el modelo de complejos condensados (8), mientras que otro conjunto de experimentos no encontró ninguna indicación de los complejos condensados y apoyó el modelo paraguas (9). Estas diferencias en las percepciones nos motivaron a desarrollar un modelo mesoscópico de un sistema de lípidos, colesterol y agua. Utilizamos simulaciones moleculares para arrojar algo de luz sobre la organización lateral del colesterol en las membranas lipídicas y las interacciones subyacentes de lípidos y colesterol que inducen el efecto de condensación.

En la literatura se han reportado varias simulaciones moleculares de modelos de colesterol en bicapas lipídicas de todo átomo y de grano grueso (para algunos ejemplos recientes, ver referencias. 10-13 y referencias incluidas). Lo ideal sería utilizar simulaciones de átomos para estudiar el efecto de condensación en un amplio rango de temperaturas y composiciones. En la actualidad, sin embargo, estas simulaciones requieren demasiado tiempo. Por lo tanto, utilizamos un modelo de grano grueso, en el que la eficiencia se gana integrando algunos de los detalles de un modelo totalmente atómico. Nuestro modelo se basa en el modelo de Kranenburg y compañeros de trabajo (14, 15). El modelo utiliza moléculas de agua explícitas. Los lípidos y el colesterol consisten en partículas hidrofílicas e hidrofóbicas (ver Fig. 1). Este modelo agrupa grupos de átomos en un pseudoátomo mesoscópico. Las interacciones intramoleculares incluyen vibraciones de enlace y flexión de enlace, cuyos parámetros se han optimizado para imitar la estructura de una molécula de fosfatidilcolina de un solo átomo en agua. Las interacciones hidrofílicas e hidrofóbicas se describen con interacciones suave-repulsivas, y los parámetros de estas interacciones se relacionan con los parámetros de solubilidad utilizando el método descrito por Groot y Rabone (16). La idea de este modelo es que las principales fuerzas impulsoras de la mezcla de colesterol y fosfolípidos son las interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas, que es la conclusión de muchos estudios experimentales (7, 9, 17). En nuestro modelo, la unidad de longitud está directamente relacionada con el tamaño efectivo de una pseudoátomos, es decir, una pseudoátomos ocupa un volumen de 90 Å3. La unidad de energía se obtiene de la coincidencia de los parámetros de repulsión blanda de las partículas de agua mesoscópicas con la compresibilidad del agua en condiciones ambientales. La simplicidad de los modelos requiere una reparametrización de estas repulsiones suaves si se cambia la temperatura. Sin embargo, en este trabajo, asumimos que los parámetros son independientes de la temperatura. La escala de temperatura se ajusta ajustándose a las temperaturas de transición de fase experimental. Más detalles y aplicaciones de este modelo se pueden encontrar en ref. 18.

Nuestro modelo de colesterol, mostrado en la Fig. 1B, se basa en las mismas suposiciones sobre el tamaño efectivo y las interacciones que el modelo de lípidos. Siguiendo a McMullen et al. (19), hicimos la parte hidrofóbica del modelo de colesterol ligeramente más larga que la parte hidrofóbica del modelo de lípidos, que tiene como objetivo representar la dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC). Para simplificar, hemos asumido que las interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas de una molécula de colesterol son similares a las de un lípido. Para obtener información sobre el mecanismo molecular del efecto condensador del colesterol, hemos introducido tres moléculas similares al colesterol en las que perturbamos el equilibrio hidrofóbico-hidrofílico de la molécula: una en la que disminuimos la longitud hidrofóbica de la cola (ver Fig. 1C), uno en el que añadimos un grupo hidrofóbico adicional (Fig. 1D), y uno en el que reemplazamos el anillo por una cadena simple (Fig. 1E).

Fig. 2 muestra el diagrama de fase de composición de temperatura computada del sistema agua-fosfolípidos-colesterol. Los límites de fase se obtuvieron a partir de una inspección visual de las instantáneas y, más cuantitativamente, de los puntos de inflexión de las curvas que dan el área por lípido, el espesor hidrofóbico promedio de la membrana y los parámetros de orden e inclinación de la cola. Estas propiedades se calcularon en función de la temperatura y el contenido de colesterol.

Primero centrémonos en las fases de lípidos puros, y el efecto del colesterol se discutirá a continuación. Para la bicapa lipídica pura, el diagrama de fases ha sido calculado por Kranenburg y Smit (14) para un sistema que es cuatro veces más pequeño. Utilizamos la misma metodología para localizar los límites de fase que Kranenburg y Smit (14). Nuestros resultados están en excelente concordancia con este estudio, lo que indica que los efectos de tamaño finito son pequeños. Para el fosfolípido puro, observamos a altas temperaturas una fase líquida (La) en la que las colas están desordenadas. A bajas temperaturas, las colas se ordenan e inclinan, lo que define la fase de gel (L’c). Estas dos fases están separadas por la fase ondulada (p’β), en la que observamos una separación microfásica de dominios en la que la bicapa es gruesa y los lípidos están ordenados y dominios en los que la bicapa es delgada y los lípidos desordenados. La presencia de estas tres fases indica que el diagrama de fases resultante está en muy buena concordancia con el diagrama experimental del lípido puro (20). La escala de temperatura se ajusta haciendo coincidir las temperaturas de las transiciones de fase de la fase de gel a la fase de ondulación (Tp) y la fase de ondulación a la fase líquida (Tm) con las temperaturas de transición de fase experimental correspondientes de DMPC puro. Se realiza una comparación adicional con los datos experimentales para el área promedio por molécula de la bicapa (Fig. 3A), para el espesor de la bicapa (Fig. 4A), y para el orden de la cola lipídica (Fig. 4B). Para el área por lípido se obtienen 56 Å2 por molécula en comparación con los experimentales (21) 60 Å2 por molécula. Para el espesor de la bicapa se calculó un valor de 38,7 Å, que se compara bien con el valor experimental de 36 Å (21), y se obtiene una concordancia similar para el orden de la cola (ver Fig. 4B). Para calcular el área por molécula de colesterol puro, simulamos una bicapa de colesterol puro. Obtuvimos un valor de 40,3 Å, que se compara muy bien con el valor experimental más reciente de 41 Å (22) para una monocapa de colesterol. Teniendo en cuenta las aproximaciones realizadas en nuestro modelo, la concordancia entre los valores experimentales y los simulados es sorprendentemente buena.

Pasemos ahora al efecto del colesterol en las propiedades de la bicapa. La primera pregunta que abordaremos es si nuestro modelo puede reproducir el efecto de condensación. Higo. 3A muestra el efecto del colesterol en el área por molécula en función de la concentración de colesterol. La comparación con los datos experimentales muestra una vez más un acuerdo muy bueno. En esta figura también mostramos el área por molécula asumiendo la mezcla ideal. Esta figura ilustra de manera convincente el efecto de condensación; el área por molécula disminuye mucho más de lo que uno esperaría sobre la base de la mezcla ideal. Otros datos experimentales incluyen el efecto del colesterol en la inflamación de las dos capas (Fig. 4A) y el parámetro de orden de cola (Fig. 4B). Tanto los datos experimentales como la simulación muestran que el colesterol aumenta el grosor de la bicapa y su orden. También para estas dos propiedades, nuestros resultados de simulación concuerdan muy bien con los datos experimentales. Los datos experimentales y de simulación (Figs. 3A y 4 A y B) muestran que la adición de colesterol modifica fuertemente las propiedades de la bicapa lipídica hasta ±30% mol de colesterol. Después de esto, se alcanza una región donde la adición adicional de colesterol solo tiene un efecto leve. A 30% mol de colesterol, tanto el área por molécula como el orden de la cola lipídica y los parámetros de inclinación tienen valores típicos de la fase de gel.

El código de colores de la Fig. 2 muestra la diferencia entre el área simulada por lípido y el valor estimado asumiendo la mezcla ideal. Observamos que a altas y bajas temperaturas, el efecto de condensación es relativamente pequeño. El efecto de condensación es máximo en una región bien definida en el espacio de fase que se encuentra justo por encima de la transición de fase principal del fosfolípido puro. Para comprender mejor la naturaleza del efecto de condensación, es importante comprender el efecto de agregar colesterol en el comportamiento de fase de la membrana.

Fig. 2 muestra las características más importantes del diagrama de fases. Las diferentes fases que observamos en nuestras simulaciones también se han observado experimentalmente, aunque no siempre para la mezcla específica de DMPC y colesterol (20, 23, 24). Sin embargo, los diferentes estudios experimentales muestran diagramas de fases cualitativamente muy diferentes, lo que limita nuestras posibilidades de hacer una comparación detallada. Las instantáneas de las diversas fases se pueden encontrar en la Fig. 5.

A temperaturas muy altas, la adición de hasta 50% mol de colesterol tiene poco efecto en la estructura de la membrana, y observamos la fase La para todas las concentraciones (24). A temperaturas por debajo de Tp, observamos que el colesterol cambia la estructura de la fase gel inhibiendo la inclinación de las colas lipídicas, causando la formación de la fase L’c (20) (comparar Fig. 5 D con E). A concentraciones de colesterol más altas (>20%), observamos la formación de pequeños racimos ricos en colesterol. Denotamos esta fase por LII, y esta fase se muestra en la Fig. 5E. A temperaturas entre Tp y Tm, la bicapa pura se encuentra en la fase de ondulación, y el colesterol transforma esta fase de ondulación (ver Fig. 5C) en una fase ordenada por líquido (23) (Fig. 5B). El término fase ordenada líquida fue introducido por Ipsen et al. (25). El espesor de la bicapa es intermedio entre el espesor del líquido y la fase de gel. Los parámetros de orden de cola de lípidos tienen valores cercanos a la fase de gel; sin embargo, al contrario de la fase de gel, los lípidos están más desordenados y no se inclinan. El colesterol aumenta gradualmente la temperatura a la que se produce la transición de fase de La a Lo. A concentraciones de colesterol muy altas, la fase ordenada por líquido se transforma en una fase de gel (LII) cuando la temperatura disminuye por debajo de la Tm. Esta fase se ha observado experimentalmente para dipalmitoilfosfatidilcolina (26), pero no hemos encontrado datos experimentales para DMPC en estas condiciones. Volvamos ahora al efecto de condensación. Higo. 2 muestra que el efecto de condensación es máximo a una temperatura justo por encima de la transición principal Tm. La razón es que en estas condiciones, la bicapa pura está en un estado de desorden líquido, mientras que la adición de colesterol a la bicapa lo transforma en una fase ordenada por líquido, que tiene un área por lípido mucho más pequeña en comparación con el estado de desorden líquido. Esta gran diferencia causa un gran efecto de condensación. A temperaturas más altas, la fase líquida permanece estable para todas las concentraciones de colesterol, dando un efecto de condensación mucho menor. A temperaturas más bajas, la bicapa lipídica pura tiene un área por lípido que está mucho más cerca del área por lípido de la fase ordenada por líquido, y como resultado el efecto de condensación es mucho menor.

Los resultados anteriores indican que el efecto de condensación es una consecuencia directa de cambios particulares en el comportamiento de fase que induce el colesterol. En la literatura hay varias especulaciones sobre aquellos aspectos de la estructura del colesterol que son específicamente responsables de su efecto condensador. Por ejemplo, el modelo paraguas se basa en la noción de que, en comparación con los fosfolípidos, la parte hidrofílica del colesterol es mucho más pequeña y necesita el fosfolípido, como paraguas, para detectar interacciones adicionales con el agua. Esto sugiere que un grupo hidrofílico adicional cambiaría las propiedades por completo. Otro factor importante es la estructura voluminosa del anillo; si reemplazamos el anillo por una cola, obtenemos una molécula que se asemeja más a una molécula de alcohol (27). Sin embargo, acortar la cola hidrofóbica tendría poco efecto. Higo. 1 muestra las moléculas de colesterol modificadas que imitan estos cambios. De hecho, los resultados en la Fig. 3B muestran que acortar la cola del colesterol muestra el mismo efecto de condensación. Sin embargo, Fig. 3B muestra que para ambas modificaciones de la molécula de colesterol, añadiendo un grupo hidrófilo adicional y reemplazando el anillo por una cadena lineal, no se observa efecto condensador. Observamos el efecto contrario: la adición de estas moléculas hace que la bicapa se expanda más en comparación con la mezcla ideal. El efecto de los alcoholes (más pequeños) en el área por molécula se ha medido experimentalmente, y los datos experimentales también muestran un aumento (28). Estrechamente relacionado con esto, observamos que en ambos casos en el diagrama de fases la fase líquida era estable en todo el rango de concentración. De hecho, observamos que la adición de estas moléculas disminuye la temperatura de transición principal, y por lo tanto no hay una región en el diagrama de fases donde haya un gran efecto de condensación.

Las simulaciones con estas variaciones estructurales del colesterol indican lo sorprendentemente sutil que es el mecanismo. La transición principal en una bicapa pura es muy sensible a las interacciones hidrofóbicas. Los grupos de cabeza de los lípidos filtran las colas hidrófobas del agua. A altas temperaturas, el área por lípido es alta, y este cribado está lejos de ser óptimo; pero en estas condiciones, la entropía de la cadena domina. La disminución de la temperatura hace que sea cada vez más importante detectar las interacciones hidrofóbicas y, en la transición principal, finalmente induce un orden de las cadenas. Un aspecto clave es entender cómo el colesterol desestabiliza la fase líquida. El colesterol tiene una cabeza hidrofílica más pequeña y, por lo tanto, es menos eficiente para proteger las interacciones hidrofóbicas. A altas temperaturas, la bicapa lipídica puede acomodar esto, pero a temperaturas más bajas, los lípidos solo pueden contribuir a la detección del colesterol al disminuir su área por lípidos. Esto causa el orden observado y explica por qué aumenta la transición principal. Los dos cambios que introdujimos en la estructura del colesterol influyen en su cribado hidrofóbico; en ambas variantes, la falta intrínseca de colesterol desaparece. Si estas moléculas se agregan a la bicapa, no hay necesidad de un cribado adicional de las interacciones hidrofóbicas, y estas moléculas evitan la formación de una fase ordenada.

Comparemos nuestras observaciones con los modelos anteriores que se han introducido para explicar el efecto de condensación. En primer lugar, nuestro modelo no da ninguna indicación de pedidos de largo alcance como se supone en el modelo de superradio. Tanto en el modelo paraguas como en los complejos condensados está implícita la suposición de algún tipo de organización local. Por ejemplo, en el modelo paraguas se asume que una molécula de lípidos podría filtrar una o dos moléculas de colesterol vecinas(véase, por ejemplo, ref. 2). Nuestras simulaciones muestran una estructura mucho más desordenada en la que no podemos identificar estas estructuras ordenadas. En este punto, es importante recordar que nuestro modelo contiene muchas suposiciones, y esto plantea la cuestión de si las conclusiones que extraemos de nuestras simulaciones son relevantes para los sistemas experimentales. Nos sorprendió mucho ver que pudimos obtener un comportamiento de fase tan rico mediante el uso de un modelo de grano grueso que utiliza fuerzas puramente repulsivas. Nuestro modelo ofrece una descripción cuantitativa muy razonable de los datos experimentales recientes sobre la estructura de la bicapa. El otro aspecto interesante es que nuestros cálculos predicen que el efecto de condensación es máximo en un rango de temperatura estrecho por encima de la transición principal. Podría ser posible verificar esto experimentalmente. Una prueba muy rigurosa de nuestro modelo habría sido una comparación detallada con el diagrama de fase experimental. En este contexto, es alentador que las fases que hemos encontrado se hayan observado experimentalmente, aunque no siempre para el sistema simulado exactamente. Al seleccionar cuidadosamente los datos experimentales que concuerdan con nuestras simulaciones, incluso podríamos afirmar que estamos de acuerdo. Una posible razón para el desacuerdo entre los diversos experimentos es que se utilizan diferentes técnicas, y no todas las técnicas son igualmente sensibles a las diferencias en la estructura de las diversas fases. Esperamos que la combinación de un diagrama de fases e información detallada sobre la estructura de las diversas fases proporcione algunas pautas sobre si una técnica experimental en particular puede identificar una transición de fase en particular.