Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y normativas pertinentes. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos.
Material
Se compararon los siguientes apósitos de plata: Acticoat (Smith& Nephew, Reino Unido; referido en este artículo como Ac), Aquacel Ag + Extra (Convatec, Reino Unido; referido en este artículo como Aq), Hidrogalinato de Silvercel (Systagenix, Reino Unido; a los que se hace referencia en el presente artículo como Sc), e Ialugen Plus (IBI, República Checa; a los que se hace referencia en el presente artículo como Ia).
Otros productos químicos se obtuvieron de Sigma–Aldrich (st Louis, USA) si no se indica lo contrario.
Preparación de extractos
En varios ensayos, se utilizaron extractos de apósitos en lugar de los propios apósitos. Estos extractos se prepararon con solución salina fisiológica (NaCl al 0,9% (p/v)) o medios de cultivo celular suplementados con suero fetal bovino (FBS) al 10%. La relación entre el área de vendaje y la solución fue de 1 cm2 por 4 ml de solución. La extracción se realizó durante 72 h en RT con agitación constante. Los extractos se esterilizaron pasándolos a través de un filtro de 0,2 µm y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.
Medición de la concentración de plata
Las concentraciones de plata en los apósitos y los extractos de apósitos se midieron mediante ICP-OES. La concentración de plata también se evaluó en muestras de piel ex vivo de cerdos. 10-70 mg de cada muestra se transfirieron a un recipiente de PTFE para digestión por microondas. Luego, 1 ml de ácido nítrico concentrado (grado de análisis de trazas, Analytika Ltd., República Checa), 0.8 ml de ácido clorhídrico concentrado (grado de análisis de trazas, Analytika Ltd., República Checa) y 0,2 ml de peróxido de hidrógeno (al 30% anual, Penta Ltd., República Checa). La muestra se digirió a 150 °C durante 5 minutos y luego, en el segundo paso del mismo ciclo, a 200 °C durante 10 minutos. Después de la digestión, la muestra se transfirió cuantitativamente utilizando 0,2 ml de peróxido de hidrógeno y agua desionizada.
El análisis se realizó con un instrumento ICP-OES (Radial 725, Agilent Technologies, Australia) equipado con un nebulizador neumático de pulverización marina y una cámara de pulverización ciclónica. La cuantificación se basó en una calibración externa. La precisión y fiabilidad del método se probaron utilizando muestras de piel de porcino enriquecidas con concentraciones conocidas de Ag a partir de una solución de referencia certificada (Analytika Ltd., República Checa).
Microscopía electrónica de barrido
Los análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) se realizaron utilizando un instrumento Zeiss Ultra Plus (Zeiss, Alemania). Las muestras se recubrieron con una capa delgada de Au/Pd en un barniz de pulverización catódica SC7620 de Quórum. Las imágenes fueron tomadas por dos detectores de electrones InLens secundarios y SE2 para mayor o menor aumento, respectivamente. Los parámetros de escaneo fueron los siguientes: voltaje de aceleración, 3,5 kV; corriente de sonda, 36 pA; y presión en la cámara, ~ 7 × 10-5 Pa.
Las imágenes EDX se capturaron con el instrumento Zeiss Ultra Plus. Los mapas y espectros de rayos X fueron tomados por un detector de rayos X X-MaxN 80 (Oxford Instruments, Reino Unido). Los parámetros EDX fueron los siguientes: tensión de aceleración, 10 kV; corriente de sonda, 300 pA; distancia de trabajo, 8,5 mm; y tiempo de proceso, 4 .
Actividad oxidativa directa de los apósitos
La generación de ROS en condiciones libres de células se evaluó utilizando 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) como sustrato para la peroxidasa de rábano picante (HRP). Se cortaron círculos de 6 mm de diámetro de los apósitos y se probaron. En resumen, la solución de trabajo consistió en 0,1 mg/ml de TMB (solución madre c = 1 mg/ml en DMSO) mezclada 1:9 con tampón citrato–fosfato de 0,05 M (pH = 5) y HRP (c final = 0,16 UI/ml). Cada pieza de vendaje se sumergió en 0,5 ml de la solución de trabajo y se recogieron muestras (25 µL) a los 0, 5, 7,5 y 10 min. Inmediatamente después de la recolección, las muestras se mezclaron en la proporción de 1:1 con 0,16 M H2SO4 y se leyó la absorbancia a 450 nm (longitud de onda de referencia = 540 nm) utilizando un instrumento NanoDrop OneC (ThermoFisher Scientific, EE.UU.). Se utilizó un 30% de H2O2 como control positivo. Se restó la señal de fondo (solución en blanco).
Penetración de plata en piel despitelizada
Utilizamos células Franz de difusión estática para investigar la penetración de plata en piel despitelizada. La piel se obtuvo de un matadero local (Bocus, Letohrad, República Checa) y se extirpó de la parte interna de la aurícula porcina. Se afeitó el cabello, se incubó la piel en PBS (60 °C, 90 s) y se despegó la epidermis. El grosor promedio de la piel despitelizada fue de 2 mm. Las piezas de piel se colocaron en una cámara y se cubrieron con un apósito plateado probado o un trozo de gasa. Cada cámara donante se llenó con 0,3 ml de medio de cultivo de FDNH con 10% de FBS. La cámara receptora contenía 0,7 ml de medio de cultivo. Las células de difusión se incubaron a 37 °C durante 24 o 48 h. Después de la incubación, se enjuagó la piel con PBS y se analizaron las partes de la piel que separaban las cámaras donante y receptor para determinar el contenido de plata mediante ICP-OES, como se describió anteriormente. La cantidad de plata que penetró a través de la piel despitelizada se midió en el líquido del donante. Se prepararon tres réplicas independientes en ambas ocasiones.
Cultivo de piel ex vivo con apósitos
Las aurículas porcinas frescas (1-2 h) (Bocus) se limpiaron escrupulosamente con jabón y Betadina (una solución yodada PVP, Egis Pharma, Hungría) y se enjuagaron con agua. Las piezas de piel (1 × 1 cm) de las aurículas se extirparon y se colocaron en una solución antibiótica (solución de penicilina–estreptomicina, 10.000 U/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina) durante 30 minutos a 37 °C bajo O2 y CO2 atmosféricos. Se colocaron muestras de piel con epidermis intacta hacia arriba en placas de cultivo de 6 pocillos con 3 mL de medio de FDN suplementado con 10% de FBS y luego se cubrieron con 1 × 1 cm de apósito con plata seleccionado o gasa de control estéril empapada con 300 µl de medio de cultivo. Las muestras se incubaron durante 24 o 48 h. Posteriormente, la piel se enjuagó con PBS y cada uno de los explantes de piel se dividió en tercios para examen histológico (fijación de PFA al 4% a 4 °C), análisis de proteínas mediante Western blot (congelación instantánea con nitrógeno líquido) y qPCR (durante la noche en RNAlater (Thermo Fisher Scientific), luego a − 80 °C).
Tinción histológica
La tinción autometalográfica de plata fue adoptada de acuerdo con Danscher et al.49. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio Eclipse 50i con una cámara DS-Fi1 conectada (Nikon, Yokohama-Shi, Japón).
Para la inmunofluorescencia de yH2AX, se desparafinizaron secciones histológicas en portaobjetos de vidrio Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se incubaron durante la noche con anticuerpo primario (1:1.000, ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, clon JBW301, Millipore, MA, EE. UU.). Luego se incubaron durante 1 h con un anticuerpo secundario (ab150114, Abcam, Cambridge, Reino Unido; dilución 1:10 000) y se montaron en portaobjetos con un Antifadante de Diamante Prolongate con DAPI (ThermoFisher Scientific). Las imágenes se capturaron con un microscopio fluorescente Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japón).
La expresión génica
La piel porcina después de la incubación con apósitos se procesó para el aislamiento de ARN, la síntesis de ADNc y la expresión génica qPCR, según lo descrito anteriormente por Klein et al.50 Ensayos de PCR en tiempo Real TaqMan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) utilizados para qPCR fueron: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. Los valores del ciclo umbral se normalizaron al gen de limpieza RPL13A y se relacionaron con muestras de control de gasa para el tiempo en particular (intervalo de 24 o 48 horas) utilizando el método 2 – δδct51. Se midieron y promediaron seis muestras independientes para cada tratamiento y tiempo. La importancia de las diferencias en la expresión génica en relación con el control de gasa se evaluó utilizando la prueba t de Student para cada apósito plateado en el tiempo especificado.
Western blotting
Para el análisis posterior de Western blot, se prepararon lisados tisulares a partir de piel porcina congelada. Usar un bisturí en una gota de tampón de lisis (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 1% Tritón X-100; 0,5% de desoxicolato de sodio; 1% de dodecilsulfato de sodio; 4% de urea), la piel se cortó en trozos pequeños, que posteriormente se homogeneizaron en 350 µl del tampón de lisis utilizando un cordón de acero inoxidable de 5 mm y un homogeneizador de tejidos (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Alemania) durante 10 min a 25 Hz. La concentración de proteínas se midió mediante un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific).
Las proteínas de los lisados se separaron utilizando gradiente de 4-15% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Para detectar proteínas específicas, las membranas se incubaron durante la noche en un tampón de bloqueo (20 mm Tris; 137 mm NaCl; 0,05% de interpolación 20; 5% de leche en polvo baja en grasa seca) con el anticuerpo primario fosfohistona H2A.X (20E3) (1:1,000; Señalización celular, EE.UU.). se utilizó β-actina como control de carga de cantidad de proteínas (1: 2000; Santa Cruz, EE.UU.). Las membranas se desarrollaron con Ig conjugada con HRP anti-conejo o anti-ratón mediante detección quimioluminiscente para visualizar señales (sustrato Clarity Western ECL; Bio-Rad, EE.UU.). Las señales se escanearon y evaluaron con un sistema de imágenes de Quimioluminiscencia Croma Alliance 9.7 (UVItec Limited, Reino Unido).
Actividad antibacteriana
Se utilizó el método de difusión de agar para comparar las actividades antimicrobianas de los apósitos. Se incubó una muestra (1 cm2) de cada vendaje en una placa de Petri recién inoculada con Staphylococcus aureus o Pseudomonas aeruginosa; estas cepas se aislaron de heridas crónicas humanas, caracterizadas y cultivadas como se describió previamente52. Además, se comparó la efectividad antimicrobiana de los extractos curativos (preparados en medio RPMI con 10% de FBS, como se describió anteriormente) mediante el método de microdilución 53. La densidad óptica se midió mediante un lector de placas multimodo Ensight (PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU.) a 600 nm durante 24 h (agitación, 37 °C).
Cultivo celular
Se compraron fibroblastos dérmicos humanos normales de piel adulta (FDNH) de Lonza (Basilea, Suiza). Los FDNH se cultivaron en medio de glucosa bajo (DMEM) de Dulbecco modificado con Águilas suplementadas con 10% de FBS, glutamina (0,3 mg/ml), glucosa (4 mg/ml), penicilina (100 unidades/mL) y estreptomicina (0,1 mg/ml) en frascos de cultivo de 75 cm2 bajo 5% de CO2 y a 37 °C hasta el quinto pasaje. Los queratinocitos HaCaT se compraron a Hölzel Diagnostika (Colonia, Alemania) y se cultivaron de la misma manera, pero sin la adición de glucosa al medio.
Medición de viabilidad
Se sembraron cinco mil células por pocillo en una placa de 96 pocillos con 200 µL del medio de cultivo con 10% de FBS en una incubadora (37 °C, 5% de CO2) durante la noche. Al día siguiente, las células fueron tratadas con 200 µL de una serie de extractos de dilución de los apósitos (100%, 50%, 20%, o 10% del extracto original diluido con medio de cultivo suplementado con 10% de FBS) durante 24, 48 y 72 h. Las células de control se trataron con un medio de cultivo estándar de FBS al 10%. La viabilidad se midió como se describió previamente54 utilizando el ensayo de bromuro de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio (MTT). Se añadió solución madre de MTT (20 µL; c = 5 mg/ml) al medio de cultivo celular en cada pocillo. Las placas se incubaron durante 2,5 h a 37 °C. A continuación, se retiró la solución MTT, se agregaron 220 µL de solución de lisis (propan-2-ol 1:1 con DMSO, Tritón X-100 al 10% (p/v) y HCl al 0,37% (p/v) y se realizó lisis durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador giratorio (150 rpm). La absorbancia se leyó a 570 y 690 nm con un lector de placas Multimodo EnSight (PerkinElmer, EE. UU.). Los datos se procesaron en Kaleido(PerkinElmer, EE. La absorbancia final se calculó como A = A570-A690. El cambio en la viabilidad de las células tratadas en relación con las células de control se calculó como cambio = (Una muestra/un control – 1) × 100.
Ensayo de inhibición por contacto directo
Las células se sembraron a una densidad de 300 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se incubaron en el medio de cultivo suplementado con 10% de FBS a 37 °C y por debajo del 5% de CO2 hasta que se logró la confluencia. Los apósitos se cortaron en cuadrados de 1 cm2, se colocaron en la capa celular y se incubaron con el medio de cultivo estándar durante 6 h. Las células de control se trataron solo con el medio. Posteriormente, las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min. Las células se teñieron con una solución violeta cristalina al 0,1% (p/v) (disuelta en etanol al 10%) durante una hora y luego se enjuagaron con agua. Las zonas de inhibición se fotografiaron con una cámara digital Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f (Canon).
Tinción fluorescente de células
Para el análisis de daños en el ADN, las células de FDNH se sembraron en portaobjetos microscópicos en una placa de 6 pocillos a una densidad de 2 × 105 por pocillo y se dejaron adherir durante la noche. Al día siguiente, las células fueron tratadas con extractos de apósito diluidos de 5 × e incubadas durante 24 h. Posteriormente, las células se fijaron con AFP al 4% durante 15 min. Después de la permeabilización y el bloqueo, los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo primario de conejo anti-yH2AX (Señalización celular, EE.UU.; dilución 1:500 en un tampón de bloqueo: 20% FBS, 0,3 M glicina, 0,05% Tween 20 en PBS; durante la noche; 4 °C). La detección se realizó utilizando un anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 555 (Abcam, Reino Unido; 1:500 en un tampón de bloqueo; 1 h, RT). Los portaobjetos se montaron con un Antifadante de diamante ProLong con DAPI (ThermoFisher Scientific). Después de secar las diapositivas, se tomaron imágenes con un microscopio fluorescente Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japón).
El estrés oxidativo intracelular se detectó utilizando una sonda DCF-DA, que es sensible a la concentración general de ROS dentro de las células. Las células se sembraron durante la noche en una placa de 24 pocillos y luego se etiquetaron con DCF-DA (1 µg/ml) durante 15 minutos, después de lo cual se trataron con extractos de apósito diluidos de 5 × y se incubaron a 37 °C y por debajo del 5% de CO2. Se utilizó H2O2 de 5 mm como control positivo. La fluorescencia verde de DCF se registró cada 15 minutos durante un período de incubación de 90 minutos utilizando un microscopio automatizado Incucyte S3 (Essen Bioscience, EE.UU.). La cuantificación de la fluorescencia intracelular se realizó en el software Fiji siguiendo el método descrito por Čepa55.
Determinación de la explosión oxidativa por neutrófilos en sangre completa
Un comité de ética independiente aprobó la recogida de muestras de sangre para el ensayo de explosión oxidativa de neutrófilos y MAT (Comité de Ética para la Investigación de la Universidad de Masaryk, Brno, Chequia, no de aprobación. EKV-2018-083). Todos los donantes dieron su consentimiento por escrito.
La ráfaga oxidativa (producción de ROS) de fagocitos sanguíneos se determinó en sangre entera diluida mediante quimioluminiscencia mejorada con luminol (CL) utilizando un luminómetro de microplacas LM-01T (Immunotech, República Checa). Brevemente, la mezcla de reacción consistió en 6 µL de sangre entera en 54 µl de medio de crecimiento RPMI-1640 mezclado con 60 µl de extracto de vendaje en solución salina fisiológica o un medio suplementado con FBS. Esta mezcla se incubó a 37 °C durante 20 min. Justo antes del inicio de la medición, agregamos 1 mm de luminol (una solución madre de 10 mm de luminol en un tampón de borato de 0,2 M) (Sondas moleculares, EE.UU.). Determinamos la producción espontánea de ROS y la producción de ROS inducida por partículas opsonizadas de zymosan (OZP—0,1 mg/ml) (Sigma-Aldrich, EE. UU.) o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA-0,8 µM; Sigma-Aldrich, USA). Se evaluaron como controles muestras no tratadas sin los extractos probados. Los ensayos se realizaron en duplicados. La quimioluminiscencia se registró de forma continua durante 90 min a 37 °C y se expresó como unidades de luz relativa (ULR). Determinamos la cantidad total de producción de ROS del área integrada bajo la curva de quimioluminiscencia.
La prueba de activación de monocitos (MAT)
la MAT se realizó en sangre humana entera heparinizada diluida en solución salina 10 veces. Se recolectaron muestras de sangre de cinco donantes sanos, se agruparon y se diluyeron con solución salina. Las muestras de sangre diluidas se incubaron con círculos de 6 mm de diámetro cortados de apósitos en microtubos estériles durante 24 h a 37 ° C. En paralelo, lipopolisacárido (LPS, c final = 0. 25 UI/ml; E-Tóxico Estándar de Endotoxina; Sigma, EE.UU.) se añadió a la segunda serie de muestras incubadas con muestras de vendaje para estimular una respuesta inmune innata a las bacterias. Las células sanguíneas se sedimentaron durante la incubación, dejando una fase superior de plasma diluido en solución salina. Después de la incubación, se recogieron 200 µL de cada muestra de plasma diluida en solución salina y se analizaron inmediatamente en duplicados para IL-6 utilizando un Kit ELISA sin recubrimiento Humano de IL-6 de acuerdo con el protocolo del fabricante (ThermoFisher Scientific, EE.UU.). La absorbancia se leyó utilizando un lector de placas Multimodo EnSight (PerkinElmer, EE. UU.) y la concentración final de IL-6 se calculó mediante Kaleido SW (Perkin Elmer, EE. UU.). El plasma restante y las células sedimentadas se almacenaron a 4 °C para evaluar la hemólisis y la toxicidad.
Hemólisis
Se detectó hemólisis en el plasma diluido en solución salina restante y en las células sedimentadas de MAT. Después de la centrifugación, se transfirieron 100 µL de cada muestra a una microplaca de 96 pocillos y se midió la absorbancia a 550 nm. Se utilizó Triton X-100 al 1% como control positivo.
Liberación de LDH
La toxicidad de los apósitos de plata en las células sanguíneas se evaluó mediante el ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH) (Detección de citotoxicidad KitPLUS, Roche, Suiza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron dos fuentes de células sanguíneas: sangre humana entera incubada con apósitos plateados como en MAT y neutrófilos aislados. La absorbancia utilizada para la corrección de fondo se midió en muestras en blanco sin el reactivo LDH. Los resultados se notifican como valores absolutos de densidad óptica en comparación con una muestra no tratada.
Análisis estadístico
Si no se indica lo contrario, se utilizó la prueba t de Student para evaluar la significación estadística de las diferencias entre muestras y controles no tratados.