Introducción
Kcat es el número de rotación the el número de molécula de sustrato que cada sitio enzimático convierte en producto por unidad de tiempo. Si conoce la concentración de sitios enzimáticos, puede ajustar Kcat en lugar de Vmax al analizar una curva de sustrato vs. velocidad.
El modelo de
Y = Et*kcat*X/(Km + X)
X es la concentración de sustrato.
Y es la velocidad de la enzima.
kcat es el número de rotación, el número de veces que cada sitio enzimático convierte el sustrato en producto por unidad de tiempo. Esto se expresa en la inversa de las unidades de tiempo del eje Y. Por ejemplo, si Y está en micromoles de sustrato por minuto, entonces kcat es el número de moléculas de sustrato producidas por sitio catalítico por minuto.
Km es la constante de Michaelis-Menten, en las mismas unidades que X. Es la concentración de sustrato necesaria para lograr una velocidad enzimática media máxima.
Et es la concentración de sitios catalíticos enzimáticos. Si la enzima tiene múltiples subunidades, tenga en cuenta que la Et es la concentración de sitios catalíticos, que pueden ser más grandes que la concentración de moléculas enzimáticas. Los valores Y introducidos son la velocidad de la enzima introducida en unidades de concentración por tiempo. El Et debe introducirse en esas mismas unidades de concentración (mientras que las unidades de tiempo están definidas por kcat).
Vmax es la velocidad máxima de la enzima en las mismas unidades que Y. No se muestra directamente en el modelo anterior. Es la velocidad de la enzima extrapolada a concentraciones muy altas de sustrato, por lo que casi siempre es más alta que cualquier velocidad medida en su experimento. Se calcula multiplicando Et por kcat.
Relación con el modelo de Michaelis-Menten
La curva mostrada arriba es idéntica a la curva definida por el modelo de Michaelis-Menten. Obtendrá curvas idénticas cuando ajuste cualquiera de los modelos a sus datos,y valores idénticos para Km.
El modelo de Michaelis-Menten encuentra la Vmax, que es la velocidad máxima de la enzima extrapolada a concentraciones muy altas de sustrato. Se expresa en las mismas unidades que utilizó para ingresar sus valores Y (actividad enzimática). Por lo general, es sencillo expresar esto (o convertirlo en ) moles/minuto/mg de proteína. La Vmáx se determina por la cantidad de sitios enzimáticos presentes (Et) y la velocidad a la que la enzima puede convertir sustrato en producto (kcat).
Si conoce la concentración de sitios enzimáticos que ha agregado al ensayo (Et), puede ajustar la constante catalítica Kcat utilizando el modelo anterior.
Al calcular Kcat, las unidades de concentración se cancelan, por lo que Kcat se expresa en unidades de tiempo inverso. Es el número de recambio, el número de moléculas de sustrato que cada sitio enzimático convierte en producto por unidad de tiempo.
Ajuste del modelo con Prisma
1.Cree una tabla de datos XY. Introduzca la concentración del sustrato en X y la velocidad de la enzima en Y. Si tiene varias condiciones experimentales, coloque la primera en la columna A, la segunda en la columna B, etc. También puede elegir los datos de muestra de Prism: Cinética enzimática Micha Michaelis-Menten.
2.Después de introducir datos, haga clic en Analizar, elija regresión no lineal, elija el panel de ecuaciones cinéticas enzimáticas y elija Kcat.
3.Debes restringir Et a un valor constante, basado en otros experimentos. Para restringir el valor de Et, vaya a la pestaña Restringir del diálogo de regresión no lineal, asegúrese de que el menú desplegable al lado de Et esté establecido en «Constante igual a» e ingrese el valor. Para los datos de muestra, ingrese 100 como el valor de Et.
Si no conoce el valor de Et, no puede ajustar el kcat, sino que debe ajustar el Vmax. No es posible que Prism se ajuste tanto al kcat como al Et, ya que los dos parámetros están entrelazados, y una curva de velocidad del sustrato no proporciona información sobre sus valores individuales.
4.Con los datos de la muestra, Prism informa que Km= 5.886 con un intervalo de confianza del 95% que varía de 3.933 a 7.839. El mejor valor de ajuste de kcat es 13,53 con un intervalo de confianza del 95% que oscila entre 11,97 y 15,09.
Notas
•Consulte la lista de supuestos de todos los análisis de cinética enzimática.
•Esta ecuación se ajusta exactamente a la misma curva que la ecuación que se ajusta a Vmax, en lugar del número de rotación Kcat. El producto de Kcat por Et (la concentración de sitios enzimáticos) es igual al Vmax.
•Esta ecuación está relacionada con la ecuación para enzimas alostéricas. Ese modelo alostérico agrega un parámetro adicional: la pendiente de la colina h. Cuando h es igual a 1.0, los dos modelos son idénticos.