A menudo hay mucha confusión sobre el significado de «unidades enzimáticas», «actividad enzimática» y «actividad enzimática específica». Esta guía explica estos conceptos clave en términos simples y discute el diseño de ensayos enzimáticos y la importancia de operar en el «rango lineal». También consideramos las curvas estándar y si debe trazar la concentración o la cantidad absoluta de producto en el eje x. Se discuten algunos consejos sobre la configuración de controles de ensayo y sustracción de espacios en blanco. Finalmente, explicamos cómo se calculan los valores de actividad enzimática y damos una visión general simple de las ecuaciones cinéticas.
Definiciones de Unidades Enzimáticas
La enzimología sería menos complicada si todos usaran la misma definición de unidad. A continuación se da una definición de unidad estándar:
1 unidad (U) es la cantidad de enzima que cataliza la reacción de 1 umol de sustrato por minuto (definición A).
En la mayoría de los ajustes R&D, 1 umol de sustrato es en realidad una gran cantidad de material y se pueden preferir otras definiciones para evitar expresar cantidades en fracciones de unidades. La siguiente definición no estándar se usa comúnmente:
1 unidad (U) es la cantidad de enzima que cataliza la reacción de 1 nmol de sustrato por minuto (definición B).
Tenga en cuenta que el cambio en la definición tiene un efecto profundo en el número indicado de unidades, es decir, 1 unidad de enzima de acuerdo con la definición A equivaldría a 1000 unidades de acuerdo con la definición B!
También puede ver unidades enzimáticas expresadas como mili-unidad (o mU), que simplemente significa una milésima de unidad, independientemente de cómo se haya definido la unidad.
Claramente, la cantidad real de una enzima en un tubo no se altera simplemente cambiando la definición de la unidad, sino que se requiere cuidado al comparar las actividades de muestras de diferentes proveedores. Siempre que se proporcionen las definiciones de unidad, puede transformar el número indicado de unidades en nmol por minuto, lo que es inequívoco y permite realizar comparaciones válidas.
Para mayor claridad en su propio trabajo, es posible que prefiera usar ‘nmol por minuto’ (o ‘umol por minuto’), aunque si se requiere repetición constante, claramente la ‘unidad’ de término mucho más corto tiene sus atractivos.
Lo que es «Actividad enzimática»
La actividad se cita en unidades por ml (U/ml), en otras palabras, nmol por minuto por ml (si se ha adoptado la definición de unidad B). Por lo tanto, los valores de actividad expresados en unidades también están sujetos a un «aumento» ilusorio de 1000 veces si se cambia de la definición de unidad A a la definición de unidad B. Una vez más, no puede haber confusión si la actividad se expresa en términos de nmol por minuto por ml en lugar de unidades por ml.
Dado que la actividad se relaciona con la concentración, se deduce que dos viales de enzima pueden contener el mismo número de unidades (en total) pero tener diferentes actividades (concentraciones).
¿Qué Es La Actividad Enzimática Específica?
La actividad enzimática específica (normalmente denominada simplemente «actividad específica») es el número de unidades enzimáticas por ml dividido por la concentración de proteína en mg/ml. Por lo tanto, los valores de actividad específicos se indican como unidades/mg o nmol/min/mg (si se aplica la definición de unidad B).
La actividad específica es una medida importante de la pureza de la enzima y los valores para diferentes lotes de una enzima pura deben ser los mismos, dentro del error experimental normal.
Las diluciones en serie de una solución enzimática tendrán diferentes valores de actividad enzimática, pero valores de actividad específicos idénticos porque al calcular la actividad específica, el numerador (unidades / ml) y el denominador (mg/ml) se ven afectados por igual por la dilución de la muestra.
Aunque la actividad específica es muy diferente de la actividad, el cálculo de la actividad específica depende del valor de la actividad, y por lo tanto el valor de actividad específico declarado también dependerá de la definición de la unidad enzimática. Los lotes que están por debajo del valor de actividad específico esperado pueden contener impurezas o moléculas enzimáticas desnaturalizadas.
Factores que afectan la Actividad Enzimática
En esta sección analizamos por qué una enzima puede tener diferentes valores de actividad medidos en diferentes laboratorios. Con esto nos referimos a diferencias reales en la actividad medida, no a diferencias aparentes causadas por el uso de definiciones de unidades diferentes.
Las condiciones en las que se lleva a cabo un ensayo influirán en los valores de actividad notificados. Por ejemplo, los ensayos típicamente se llevan a cabo a una temperatura entre 20-37°C. En términos generales, una enzima será más activa a 37°C que a 20°C.
La definición de la unidad enzimática se expresaría mejor así:
1 unidad (U) es la cantidad de enzima if que cataliza la reacción de 1 nmol de sustrato por minuto en condiciones estándar.
Desafortunadamente, el término ‘condiciones estándar’ está abierto a la interpretación y puede haber diferentes preferencias de usuario, al menos en entornos R&D. Por lo tanto, diez laboratorios de investigación diferentes pueden (bastante correctamente) calcular diferentes actividades para la misma solución de enzima. La mayoría de los laboratorios de investigación establecen sus propias «condiciones estándar» y comprueban internamente cada nuevo lote. En los entornos clínicos, se definen explícitamente las «condiciones estándar» y se requiere que todos los laboratorios realicen ensayos idénticos.
Desarrollo de ensayos y la Importancia del Rango lineal
El valor de actividad (unidades / ml) de su enzima es el parámetro más importante cuando está desarrollando un ensayo. Esto se debe a que el volumen (es decir, el número de unidades) que agregue determinará la cantidad de sustrato que se convierte en producto. Recuerde, 1 unidad cataliza la conversión de 1 nmol de sustrato por minuto (definición B).
Las unidades/ml notificadas pueden darle una idea aproximada de cuánta enzima agregar, pero como el valor de actividad puede no haberse determinado en una prueba idéntica a la suya, es habitual preparar diluciones en serie de la enzima (por ejemplo, diluciones logarítmicas inicialmente) y probar un volumen fijo de cada dilución. Dependiendo de la señal de ensayo (que estará relacionada con la cantidad de sustrato convertido), puede ser necesario realizar un segundo experimento para obtener una dilución adecuada.
¿Cuál es exactamente la «mejor» dilución? Para responder a esto, necesitamos pensar en el aspecto más importante del diseño del ensayo: el rango lineal. Es importante para el trabajo cuantitativo operar en un rango en el que una gráfica de señal de ensayo (a menudo absorbancia) versus concentración enzimática sea lineal. La mayoría de los ensayos son lineales si el grado de conversión del sustrato es inferior al 15%, suponiendo que no haya otros factores limitantes. Fijando el tiempo de ensayo (por ejemplo, 30 min) y la temperatura (por ejemplo, 25oC), el grado de conversión se puede controlar simplemente ajustando un parámetro, es decir, el número de unidades enzimáticas añadidas.
Esto se ilustra gráficamente en la Figura 1 con diluciones expresadas como recíprocas (es decir, dilución de 1/10 = 0,1 en el eje x). Su propia gráfica puede diferir en su forma y rango lineal, pero a una concentración enzimática muy alta, sin duda, la señal de ensayo no aumentará en proporción a la cantidad de enzima agregada.
El ensayo de la Figura 1 es lineal hasta una densidad óptica (DO) de 2,5 y un factor de dilución de 0,02 (1/50 de dilución de la enzima) sería ideal para el trabajo de ensayo, ya que da una señal grande (~1,5) y se encuentra en el medio del rango lineal. Los cálculos basados en los resultados de los factores de dilución en el rango comprendido entre 0,04 y 0,12 (es decir, la región con pendiente reducida) subestimarán el nivel real de actividad enzimática porque algo está limitando claramente la magnitud de la señal de ensayo.
Muchos factores pueden operar para limitar el rango lineal y el rango varía de ensayo a ensayo. Una razón común para la no linealidad es el consumo excesivo de sustrato, que puede causar una caída de la velocidad de reacción, pero las limitaciones de los componentes ópticos del lector de placas (o cualquier dispositivo de medición utilizado) también pueden ser significativas. La mayoría de los lectores de placas, por ejemplo, no pueden medir de forma fiable valores de absorbancia superiores a 3 y esta limitación se aplicará independientemente del porcentaje del sustrato que se haya convertido en producto.
Fig 1. Absorbancia Versus Cantidad de Enzima
Aunque no se discute de otra manera en esta guía, también se debe tener en cuenta que las enzimas pueden desnaturalizarse con el tiempo, especialmente si están muy diluidas, y los productos de algunas reacciones pueden inhibir la enzima. De hecho, hay otras posibles razones para el comportamiento no lineal, pero generalmente es relativamente fácil encontrar el rango lineal por ensayo y error utilizando diluciones en serie de la enzima como se describió anteriormente.
Tiempo y temperatura de ensayo
Estos parámetros también pueden influir en el rango lineal, ya que afectan a la tasa de conversión del sustrato. Por ejemplo, un ensayo puede ser lineal después de 15 minutos, pero a los 60 minutos se puede haber consumido demasiado sustrato. En esta situación, tendría que reducir la cantidad de enzima para ejecutar su ensayo durante 60 minutos. Las mismas consideraciones se aplican a la temperatura del ensayo, ya que también puede afectar a la velocidad de reacción.
La mayoría de las personas adoptan un tiempo de ensayo de entre 15 y 60 minutos. Se deben evitar tiempos muy cortos (por ejemplo, 2 minutos) porque un ligero retraso en detener la reacción provocará un error significativo en el cálculo de la actividad. Es importante asegurarse de que los reactivos almacenados en un refrigerador o congelador se hayan equilibrado a la temperatura correcta antes de su uso, y esto es especialmente importante si tiene un tiempo de ensayo relativamente corto.
Volumen/Sensibilidad del ensayo
Desde una perspectiva práctica, el volumen del ensayo está determinado/limitado por el elemento consumible que utilice para sus ensayos (por ejemplo, cubetas, tubos o microplacas). La señal para la mayoría de los ensayos enzimáticos es proporcional al volumen del ensayo y los intentos de miniaturizar el ensayo (por ejemplo, para conservar los reactivos) generalmente conducirán a señales más bajas. Sin embargo, los ensayos de absorbancia a menudo son una excepción, y un cambio de una cubeta de 3 ml a una micro cubeta de 1 ml, por ejemplo, no cambiará la lectura de absorbancia si el ancho (longitud de la trayectoria) de la cubeta sigue siendo de 1 cm (p. ej. la luz todavía pasa a través de la misma «longitud» del líquido). Esto se debe a que la absorbancia es proporcional a la longitud de la trayectoria, no al volumen de la muestra.
En los ensayos de absorbancia de microplacas, la longitud de la trayectoria es igual a la profundidad del líquido, y es posible miniaturizar sin pérdida de señal reduciendo el diámetro de los pozos y manteniendo una profundidad constante del líquido. Por ejemplo, las placas de 96 pocillos pueden acomodar fácilmente 200ul de muestra, pero con un volumen de ensayo de 50ul, sería mejor usar una placa de 384 pocillos para aumentar la longitud del camino sobre la que se ve con 50ul de muestra en una placa de 96 pocillos.
Ensayos continuos (Medición de la apariencia del producto a lo largo del tiempo)
La mayoría de los ensayos se llevan a cabo durante un período de tiempo fijo (ensayos de punto final) y la reacción se detiene mediante la adición de un reactivo de parada (por ejemplo, ácido). Sin embargo, en ensayos continuos, la apariencia del producto (con menos frecuencia, el consumo de sustrato) se registra de forma continua (p. ej. por medio de un registrador de gráficos). Se aplican las mismas reglas básicas; una gráfica de señal versus tiempo para una cantidad fija de enzima debe ser lineal y la velocidad debe duplicarse si la cantidad de enzima se duplica. Siempre que el ensayo se realice en el rango lineal, la actividad de las «incógnitas» diluidas adecuadamente puede determinarse con precisión a partir de las velocidades de reacción iniciales medidas con un conjunto de patrones.
¿Qué Concentración De Sustrato Debo Usar?
La concentración del sustrato influirá en la velocidad de reacción, pero hay varios factores a considerar al seleccionar la concentración «correcta». Desde un punto de vista práctico, una consideración clave es la cantidad de producto que debe generarse para dar una señal de ensayo mensurable. Dado que es probable que la velocidad de una reacción enzimática disminuya cuando se hidroliza más del 15% del sustrato, la concentración inicial del sustrato debe ser, por lo general, de al menos 10 veces la concentración del producto que se sabe que da una señal de ensayo aceptable.
Otra consideración es la Km para el sustrato. Si bien agregar más sustrato generalmente significa que verá valores de actividad más altos, la relación no es lineal y es posible que deba considerarse el costo del sustrato. En este punto, probablemente sea útil introducir la ecuación clásica de Michaelis-Menten:
v = (Vmax S) / (Km + S)……………. Eqn. (1)
donde v es la velocidad, Vmax es la velocidad máxima posible, S es la concentración del sustrato y Km es igual a la concentración del sustrato que da la mitad de la actividad máxima. La derivación de esta ecuación y sus supuestos subyacentes pueden encontrarse en cualquier libro de texto sobre cinética enzimática. Aunque es normal medir en lugar de calcular la velocidad de las reacciones enzimáticas, es útil comprender los principios subyacentes para el diseño del ensayo.
La ecuación de Michaelis-Menten es útil porque le ayuda a seleccionar una concentración adecuada de sustrato si se conoce el Km.
Cuando S = Km, v =(Vmax S)/2S, es decir, v/Vmax = S / 2S = ½.
En otras palabras, la enzima funcionará al 50% de su velocidad máxima posible cuando S=Km.
Al sustituir en la ecuación 1 los valores de S = 10 y Km = 1, verá que al aumentar la concentración de sustrato 10 veces, la enzima ahora funciona a ~90% de la velocidad máxima posible, en lugar de 50%. Claramente esto es más alto, pero no 10 veces más alto.
A concentraciones muy altas de sustrato, el Km de la ecuación 1 se vuelve numéricamente insignificante y la velocidad medida equivale a Vmax.
Muchos ensayos se realizan con una concentración de sustrato en o alrededor del valor Km, pero si el Km es muy alto, puede que no sea posible utilizar una concentración de sustrato tan alta (p. ej. por razones de costo o solubilidad limitada).
En algunas situaciones puede ser incluso aconsejable utilizar una concentración relativamente baja de sustrato. Por ejemplo, en el descubrimiento de fármacos, el uso de concentraciones de sustrato muy altas dificultaría la identificación de inhibidores enzimáticos competitivos (los inhibidores competitivos se unen al mismo sitio que el sustrato).
Se debe lograr un equilibrio de los diversos factores para que el ensayo tenga una señal medible, pueda operarse en el rango lineal y pueda cumplir cualquier otro objetivo del ensayo (por ejemplo, costo, tiempo, etc.).
Curvas estándar
Siempre se requiere una curva estándar si desea calcular la actividad enzimática. No es esencial si solo está interesado en valores de actividad relativos.
La curva estándar se construye midiendo la señal de ensayo con soluciones estándar del producto de reacción en un rango adecuado de concentraciones. Idealmente, debería ejecutar una curva estándar para cada experimento, pero si la curva estándar es altamente reproducible, puede ser aceptable ejecutarla periódicamente.
Una curva estándar típica se muestra en la Figura 2 a continuación. Esta es una curva estándar para un ensayo de ATPasa, en la que el ATP se hidroliza a ADP y Pi (fosfato inorgánico).
Fig 2. Curva estándar para Pi
El fosfato se detecta por medio de un reactivo aglutinante de tinte que cambia de color en presencia de fosfato. Sin embargo, las características específicas de este ensayo no son importantes en este caso; cualquiera que sea la naturaleza del producto o el método de detección que se utilice, debe construirse una curva estándar que muestre la dependencia de la señal de la cantidad de producto en el ensayo. La «curva» (idealmente es una línea recta) se utiliza para determinar la cantidad de producto generado en muestras con actividad desconocida, es decir, a partir del valor de absorbancia, leyendo la intersección en el eje x. (La mayoría de los paquetes de software gráficos calcularán automáticamente los valores de x a partir de los valores medidos de y). La cantidad de actividad se puede calcular (ver más adelante).
¿Grafico la Concentración o la Cantidad Absoluta en el Eje X?
Aquí no hay una respuesta correcta única, y la posibilidad de usar cualquiera de los dos enfoques a menudo puede causar confusión cuando se calculan los valores de actividad. Por ejemplo, trazar nmol de producto en el eje x es muy conveniente si necesita calcular valores de actividad (recuerde, actividad = nmol por minuto por ml). Sin embargo, los reactivos de laboratorio generalmente se preparan a concentraciones conocidas, y a menudo es más fácil trazar estos valores en el eje x. Sin embargo, al calcular la actividad (o actividad específica) de su enzima, debe recordar convertir la concentración en el eje x en el número de nmoles de producto formado, lo que significa que debe tener en cuenta el volumen de ensayo. La razón es fácil de entender: los volúmenes de 50ul y 100ul de una solución estándar estarán a la misma concentración, pero el volumen más grande contendrá el doble de la cantidad de producto. En general, es mejor elegir un enfoque (es decir, trazar la cantidad absoluta de producto o la concentración) para que siempre se use el mismo método de cálculo de la actividad.
Controles y Sustracción de Datos «En blanco»
Los controles adecuados son de vital importancia para el trabajo cuantitativo, al igual que el uso correcto de los datos de control en los cálculos.
Los controles le indican (indirectamente) cuánta señal de ensayo se debe a la acción de la enzima y cuánta surge por otras razones. Una fuente común de señal «falsa» es el sustrato (que a menudo puede estar contaminado con el producto). Otros componentes del ensayo también pueden dar lugar a una pequeña señal dependiendo de la naturaleza de los componentes y del tipo de ensayo. El propósito de los controles es permitirle eliminar (por sustracción) cualquier elemento de la señal total que no esté relacionado con la acción de la enzima. Si el ensayo está bien diseñado y los reactivos de ensayo son de buena calidad, el tratamiento de los controles suele ser bastante sencillo.
A continuación se dan algunas pautas generales:
Si volvemos al ensayo colorimétrico para detectar fosfato inorgánico, podemos destacar algunos problemas potenciales que se detectan fácilmente con los controles adecuados.
El reactivo de detección de fosfato proporciona una lectura baja de aproximadamente 0,08 en una placa de 96 pocillos a la longitud de onda utilizada para la medición (alrededor de 650 nm).
Podemos configurar los siguientes ensayos / controles (lecturas entre paréntesis en una situación hipotética de ensayo):
- Todos los componentes del ensayo menos la enzima (0.5)
- Enzima por sí sola (0.1)
- Enzima más todos los demás componentes (1.8)
Claramente, la señal de ensayo de 1.8 no se debe únicamente a la acción de la enzima sobre el sustrato.
Para cualquier ensayo enzimático, un control clave (A) es omitir la enzima (y reemplazarla con tampón). Esto le dará la señal de fondo para todos los demás componentes del ensayo como grupo, incluido el sustrato que puede contener una pequeña cantidad de producto. Este control no le indica la señal de fondo de la enzima, pero está claro que no puede agregar la enzima al sustrato como control. En la mayoría de los ensayos, la enzima no da señal porque se diluye significativamente antes de su uso en el ensayo. Esto se puede comprobar fácilmente, como en B anterior.
Los datos de la muestra A (arriba) sugieren que la mezcla está contaminada con fosfato inorgánico. Los componentes individuales se pueden comprobar para identificar la fuente del problema. Esta situación es bastante común para los ensayos de ATPasas y otras enzimas generadoras de fosfato, ya que los sustratos a menudo son inestables y están parcialmente hidrolizados para dar algo de fosfato inorgánico.
Puede ser incómodo corregir datos sin procesar si varios componentes dan señales falsas; la eliminación del problema en la fuente es generalmente mucho mejor que cualquier tratamiento matemático. El valor «corregido» para la muestra C anterior puede parecer 1.2 (p. ej. 1.8 – 0.5 – 0.1) pero estrictamente hablando, esto está mal. Recuerde que la placa de ensayo y el reactivo de detección proporcionan una señal de fondo de alrededor de 0,08, por lo que la fuente de la mayor parte de la señal para el control A es el plástico de la placa y/o el reactivo de detección. La misma señal pequeña también debe ocultarse dentro del valor para el control de enzimas. Por lo tanto, en la corrección aplicada anteriormente hemos restado este espacio en blanco oculto dos veces.
Siempre tendrá que restar controles de los datos del ensayo, y es preferible combinar todas las sustancias (excepto las enzimas) y restar un solo valor. Si se adopta este enfoque, la curva estándar se trata de la misma manera y se resta un valor de control (es decir, el valor obtenido en ausencia de producto, es decir, análogo a la placa/reactivo en blanco mencionada anteriormente). Por lo tanto, ni los datos de ensayo sustraídos ni la curva estándar sustraída contienen la señal de fondo potencialmente engañosa causada por la placa/reactivo de ensayo.
Finalmente, como hemos visto, las señales falsas se detectan fácilmente con controles adecuados, pero la mejor estrategia para obtener datos de buena calidad es usar reactivos con fondos bajos para que los valores de los controles sean bajos. También es útil para generar una señal de ensayo (debido a la enzima) que es mucho más alta que cualquier señal de fondo. Idealmente, la relación señal-fondo debe ser de al menos 5 y preferiblemente de 10 o más para un trabajo cuantitativo preciso.
Calcular los valores de actividad
Esto es bastante fácil de entender si calculamos a partir de datos de ensayo sin procesar de manera gradual. Por ejemplo, digamos que hemos generado 10 nm de producto en nuestra reacción enzimática (es decir, determinada a partir de la curva estándar de la señal frente a la cantidad absoluta de producto). Dado que la actividad se expresa como nmol por minuto por ml, necesitamos considerar el tiempo y el volumen y, quizás menos obviamente, la cantidad y la dilución de la enzima para calcular la actividad.
Si el ensayo dura 10 minutos, el número de nmol por minuto en el ejemplo anterior es 1. (paso 1)
Si el volumen de ensayo es de 200ul, necesitamos multiplicar por 5 (es decir, 1000/200) para obtener nmol por minuto por ml. (paso 2)
Este valor se refiere a la actividad de la enzima en el ensayo, no en la muestra de enzima utilizada para configurar el ensayo. Se necesitan algunos factores de corrección adicionales para determinar la actividad enzimática en la muestra original de enzima.
La enzima puede haberse diluido antes de su uso, y debe diluirse aún más con los otros componentes presentes en el ensayo. Si el ensayo (200ul en total) comprende 20ul de enzima, y la enzima se diluye 1/100 antes de agregar la muestra de 20ul, probablemente vea que debemos multiplicar primero por 10 (paso 3) y luego por 100 (paso 4) para obtener la actividad de la enzima en la solución enzimática original.
Hasta ahora esto es relativamente sencillo. Sin embargo, mencionamos anteriormente que la concentración a menudo se representa en el eje x de la curva estándar. Por lo tanto, los valores pueden expresarse en términos de mM (no mmol) y no se puede determinar el número de mmol simplemente inspeccionando la curva estándar.
Dado que mM significa mmoles por litro, tenemos una discrepancia entre el volumen implícito de 1L y el volumen de ensayo real. Por lo tanto, si tenemos un producto de 10 mm y el volumen de ensayo es de 200ul, debemos dividirlo por 5000 para obtener el número de mmoles de producto.
Puede notar aquí que dividir por 5000 aquí compensa algunas de las operaciones de multiplicación que se requerían anteriormente. De hecho, es bastante normal que los factores de corrección se cancelen. Por ejemplo, en un ensayo de 10 minutos utilizando 1/10 de enzima diluida, se dividirá por 10 para obtener nmol por minuto y se multiplicará por 10 más adelante para corregir el factor de dilución.
Se deduce que si siempre se utilizan condiciones de ensayo estándar (p. ej. su estándar), podrá multiplicar el valor ‘x’ de la curva estándar por un solo factor de corrección global, que abarca todos los demás factores de corrección individuales, para calcular los valores de su actividad. Solo en la primera ocasión es necesario identificar los factores de corrección individuales.
Inhibición Enzimática / Detección de Fármacos
Este es un área de la enzimología en la que sigue siendo necesario operar en el rango lineal, pero donde los cálculos de los valores de actividad generalmente no son relevantes; más bien, la velocidad relativa de reacción (o la cantidad relativa de producto formado) en presencia y ausencia de una sustancia problema es clave, lo que requiere poco más que simples cálculos utilizando los datos de ensayo restados en blanco. Tras restar los espacios en blanco, la cantidad de producto formado se expresa como porcentaje de la cantidad obtenida en ausencia de la sustancia problema (es decir, el 100%). Estos ensayos a veces se pueden ejecutar con proporciones de señal a fondo bastante bajas, porque la pregunta que se hace es: ¿inhibe la sustancia problema la reacción?
– solo requiere una respuesta sí / no.
Resumen
Se espera que esta guía haya proporcionado explicaciones claras de «unidades enzimáticas», «actividad enzimática» y «actividad enzimática específica», y definiciones de unidades y la importancia del «rango lineal». Los detalles de lo que se debe trazar en el eje x de las curvas estándar es una cuestión de preferencia del usuario, pero se requiere un poco de cuidado cuando se calculan las actividades. Los controles de ensayo son importantes, pero el uso de reactivos de alta calidad es mejor que la eliminación de fondos utilizando enfoques matemáticos. Una alta relación señal / fondo es deseable para el trabajo cuantitativo y se pueden variar varios parámetros para aumentar la señal de ensayo; no siempre es necesario simplemente agregar más enzimas. Los valores de actividad enzimática se pueden calcular fácilmente si se utiliza un enfoque gradual para identificar las variables clave del ensayo.
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