Identificación de Bordetella pertussis en un Paciente Infectado por el Virus de Inmunodeficiencia Humana Críticamente Enfermo mediante Análisis Genotípico Directo de Material Teñido por Gram y Discriminación de B. holmesii mediante el uso de un Sitio Único de Enzima de Restricción del Gen recA

La identificación de bacterias a partir de muestras clínicas se realiza en gran medida mediante caracterización fenotípica después de cultivo in vitro y microscopía. Sin embargo, no es raro que las preparaciones teñidas directamente con Gram revelen muchos organismos, pero los cultivos no demuestran un patógeno. Esto se ilustra en un caso clínico reciente, en el que un varón de 48 años con SIDA ingresó con coccidioidomicosis pulmonar. A pesar de la terapia antifúngica, su estado no mejoró. Las muestras de esputo revelaron muchos bacilos gramnegativos en microscopía directa, pero no patógenos en el cultivo. Además, varios hemocultivos crecieron bastones gramnegativos exigentes, que no podían especiarse con métodos convencionales.

Decidimos intentar la identificación de los dos aislados por métodos genotípicos utilizando cebadores de oligonucleótidos universales dirigidos al gen de la subunidad pequeña ARNr (ARNr 16S). De las muestras respiratorias, sin embargo, solo se disponía de portaobjetos teñidos con Gram. Por lo tanto, desarrollamos un nuevo método, en el que el ADN bacteriano se recupera directamente del portaobjetos teñido con Gram. Los portaobjetos fueron teñidos por gram con la metodología tradicional (12). Se untó un portaobjetos de vidrio transparente con muestras y se trató con metanol absoluto (Mallinckrodt, Hazelwood, Mo.), seguido de fijación de calor a 65°C y tratamiento con solución cristalina violeta (Remel, Lenexa, Kans.). El portaobjetos se trató posteriormente con yodo de Gram (Remel), se decoloró con solución de alcohol-acetona (3:1) y se coloreó con safranina (Remel). El aceite de inmersión se eliminó primero del portaobjetos con 100% de xileno (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.), seguido de enjuague en etanol al 100%. Luego, el material se desechó con una hoja de afeitar recta, suspendida en 50 µl de solución de hidratación de ADN de Puregeno (Gentra, Minneapolis, Minn.), en vórtice y hervido durante 10 min. Para el análisis del aislado de sangre, se utilizó material de la botella de BACTEC y de colonias cultivadas en medio sólido. La PCR posterior se realizó en un volumen de 50 µl que contenía 5 µl de la plantilla, 1,5 mm MgCl2, 100 µM cada trifosfato de desoxinucleósido (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, Ind.), 1 U de polimerasa de ADN Taq (Roche Diagnostics Corporation) y cebadores universales 16S rRNA de 0,15 µM (cada uno) 11E (5′-GAGGAAGGGGGATGACG-3′) y 13B (5′-TCCGGGCCCTTGCATAAGTG-3′) como se describió anteriormente (15). Después de un paso de desnaturalización de 5 minutos a 94°C, se repitieron 30 veces pasos de PCR de 94°C para 60 s, 50°C para 60 s y 72°C para 90 s en un sistema de PCR GeneAmp de Perkin-Elmer 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, California.). Los productos se obtuvieron de esputo y sangre (Fig. 1). Estos se purificaron con el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen Inc., Valencia, California.), y la secuenciación de ADN se realizó en un secuenciador ABI3100 de Applied Biosystems (HHMI Biopolymer / W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Facultad de Medicina de la Universidad de Yale). La comparación posterior con la base de datos pública (GenBank) por BLAST (1) identificó el aislado sanguíneo como Helicobacter cinaedi o Helicobacter rappini. Ambos organismos se han asociado con bacteremias en pacientes inmunodeprimidos (9, 10, 13, 16, 17). El producto de PCR del aislado respiratorio coincidió con los genes ARNr 16S de Bordetella pertussis y Bordetella holmesii, que son homólogos en un 99,5% e idénticos en la región amplificada (18).

Con el fin de especializar el aislado respiratorio de Bordetella y validar el resultado del análisis genotípico, se desarrolló un ensayo discriminatorio en el que se seleccionó una porción del gen recA (6, 7), que contiene un sitio único de enzima de restricción. Amplificación de B. pertussis (ATCC 9340; American Type Culture Collection, Manassas, Va.) y el ADN de B. holmesii (ATCC 51541), así como el de la tinción de gramo de esputo de nuestro paciente, se llevaron a cabo como se describió anteriormente, excepto que MgCl2 de 3 mM y cebadores específicos de nuevo diseño (forward, 5 ‘- CAATACGCCTCCAAGCTGGG-3′; y viceversa, se utilizaron 5′-TGATGTCGAACTCGGCCTGC-3’), y los pasos de PCR (94°C para 30 s, 59°C para 30 s y 72°C para 60 s) se repitieron 45 veces seguidas de un paso de elongación final a 72°C. Los productos se digerieron con NciI de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (New England Biolabs, Inc. Beverly, Misa.). Los dos organismos se pueden distinguir fácilmente porque B. holmesii tiene dos sitios NciI, mientras que B. pertussis y todas las demás Bordetella spp. solo tiene un sitio del NciI dentro de la región amplificada. El aislado de esputo se identificó posteriormente como B. pertussis (Fig. 2) y se ha notificado como patógeno pulmonar oportunista en pacientes infectados por el virus de inmunodeficiencia humana (4, 5).

A continuación investigamos si la identificación genotípica de organismos directamente a partir de preparaciones clínicas de tinción de Gram con cebadores universales es un método factible y reproducible. El tipo de fijación (calor, metanol al 100% y etanol al 100%) y la presencia de restos de tinte después de la tinción de Gramo como se describe anteriormente no interfieren con la PCR. Se encontró un límite de detección de 1.500 UFC/µl de esputo (de 6 a 30 organismos por campo de inmersión en aceite), similar al de otros informes (14). Para este hallazgo, se agruparon tres muestras de esputo clínico aleatorias sin bacterias en tinción de Gram o en cultivo, se añadieron cantidades definidas de Escherichia coli (ATCC 25922), fijas y teñidas de Gram, y se rasparon del portaobjetos como se describió anteriormente. Se probaron varias muestras clínicas elegidas al azar, y cuando un organismo predominante era visible en la microscopía, su identificación coincidía con el patógeno cultivado (Tabla 1).

Nuestro método tiene varias ventajas sobre los ensayos descritos anteriormente. A diferencia de informes anteriores, en los que el ADN se extrae primero del esputo y se utilizan cebadores específicos de la especie(2, 11, 14, 19, 20), nuestro ensayo utiliza ADN recuperado directamente de portaobjetos teñidos con gram sin pasos de extracción y utiliza cebadores universales, lo que permite la identificación de una amplia gama de bacterias con un protocolo simple. Como se muestra, esto se puede lograr incluso en presencia de flora residente de fondo normal porque el número de ciclos de PCR es limitado, lo que permite una amplificación competitiva del ADN bacteriano. Dado que la calidad de la muestra presentada y las proporciones relativas de microbios morfológicamente diferentes se pueden determinar fácilmente en tinciones de Gram, se pueden seleccionar frotis adecuados antes de la amplificación del ADN. Además, la apariencia de tinción de Gram del organismo predominante sirve como control de calidad interno después de la identificación genotípica. Al igual que con la identificación fenotípica, los resultados de nuestro ensayo deben correlacionarse con el cuadro clínico antes de tomar decisiones de tratamiento, ya que ninguno de los métodos puede distinguir de manera confiable entre colonización e infección.

Entre los pocos informes en la literatura en inglés que describen la recuperación de ácido nucleico de muestras clínicas en portaobjetos de vidrio (3, 8), ninguno hasta ahora ha descrito la amplificación del ADN después de la recuperación de bacterias de portaobjetos teñidos con Gram. Nuestro método es rápido y fiable y se puede utilizar como herramienta en casos en los que los organismos se ven en abundancia en portaobjetos clínicos teñidos con Gram, pero no se pueden recuperar en cultivo. La técnica puede ser particularmente útil cuando se busca un diagnóstico retrospectivo o después de que se hayan descartado las muestras originales.

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