Jackson comenzó a actuar en un pequeño papel en la película Crooked Hearts en 1991. Al año siguiente, interpretó el papel de Charlie en una versión musical de Willie Wonka y la fábrica de chocolate. En este punto, con la ayuda de la directora de casting de la obra, Laura Kennedy, se unió a la Agencia William Morris. Poco después, consiguió el papel de Charlie (#96) en la serie Mighty Ducks, interpretando a un joven y aspirante a jugador de hockey.
Joshua Jackson pasó a aparecer como Pacey Witter en Dawson’s Creek, que fue creado por Kevin Williamson y corrió en la red WB de 1998 a 2003, y también protagonizó James Van Der Beek, Michelle Williams y Katie Holmes. Mientras el programa estaba en pausa, apareció en varias películas, incluyendo Cruel Intentions (una adaptación yuppie de Nueva York de Les Liaisons dangereuses que también protagonizó Sarah Michelle Gellar y Ryan Phillippe), The Skulls, The Safety of Objects, The Laramie Project y un breve cameo en el remake de Ocean’s Eleven en el que aparece como él mismo en una escena de póquer con Brad Pitt, George Clooney y Holly Marie Combs, entre otros. En 2000, también fue estrella invitada en la temporada 12 de Los Simpson, expresando el personaje de Jesse Grass, un » ecologista guapo «e interés amoroso por Lisa Simpson en el episodio»Lisa la abrazadora de árboles». También fue elegido como «Beau» en la película Gossip en 2000 con los actores James Marsden, Kate Hudson y Norman Reedus.
Poco después de que Dawson’s Creek terminara en 2003, Jackson interpretó el papel principal en películas junto a Dennis Hopper (Americano), Harvey Keitel (Sombras en el Sol) y Donald Sutherland (Aurora Boreal). En 2005, Jackson se mudó al Reino Unido e hizo su debut teatral en el West End de Londres con Patrick Stewart en la obra de dos hombres de David Mamet, A Life in the Theatre. La obra fue un éxito de crítica y popularidad, y se estrenó de febrero a abril de ese año. Jackson dijo que consideraría volver al escenario, para probar suerte en Broadway. Su siguiente papel en el cine fue en Bobby, dirigida por Emilio Estévez, co-estrella de Jackson de The Mighty Ducks. Interpretó un papel principal en Shutter, un remake estadounidense de una película de terror tailandesa del mismo nombre. Protagonizó y actuó como productor ejecutivo en la película independiente canadiense One Week, que se estrenó el 6 de marzo de 2009.
De 2008 a 2013, Jackson interpretó el papel principal de Peter Bishop en la serie de ciencia ficción Fringe, creada por JJ Abrams, Roberto Orci y Alex Kurtzman. La serie apareció en la cadena de televisión Fox y fue el segundo programa nuevo con mejor calificación de la temporada 2008-2009 después de The Mentalist de CBS. BuddyTV lo clasificó #9 en su lista de» Los 100 Hombres más sexys de la televisión de 2010″, #19 en 2011 y #14 en 2012.
Jackson fue nominado al Premio Genie a la Mejor Interpretación de un Actor en un Papel Principal para la película One Week. Ganó el premio el 12 de abril de 2010. Organizó y presentó la satírica Pacey-Con en 2010, justo al otro lado de la calle de la Comic-Con de San Diego, luciendo una camiseta de bolos y dando ficción de fans, escrita por fanáticos de Dawson’s Creek, a los que esperaban en la fila de entrada de la Comic-Con. Las imágenes del evento se grabaron para un video, titulado ‘Pacey-Con’, que estaba filmando para el sitio web de humor Divertido o Die celebrity de Will Ferrell. En 2013, Jackson apareció en la película de la CFI Inescapable con Marisa Tomei y Alexander Siddig. Jackson escribió la primera historia de la trilogía de cómics Beyond the Fringe, titulada «Peter and the Machine». Jackson protagonizó el exitoso programa de televisión de Showtime, The Affair, donde interpretó a Cole Lockhart, el esposo protagonista de la infiel Alison Lockhart.
En marzo de 2018, Jackson hizo su debut teatral en Broadway, Children of a Lesser God, donde interpretó a James Leeds, un profesor poco convencional en la escuela para sordos que se encuentra en una relación profesional y romántica conflictiva con una ex estudiante sorda, Sarah Norman (Lauren Ridloff). La obra duró hasta mayo de 2018.
En 2019, Jackson interpretó al abogado defensor Mickey Joseph en la miniserie de drama de Netflix When They See Us.
En 2020, Jackson co-protagonizó con Reese Witherspoon y Kerry Washington en la miniserie de Hulu Little Fires Everywhere basada en la novela de Celeste Ng.
Jackson ha sido elegido para el papel principal en Dr. Death, basado en el podcast del mismo nombre.