Cromatografía líquida de alto rendimiento La espectrometría de masas es una técnica instrumental extremadamente versátil cuyas raíces se encuentran en la aplicación de la cromatografía líquida más tradicional a teorías e instrumentación que se desarrollaron originalmente para la cromatografía de gases (GC). Como su nombre indica, la instrumentación comprende un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento (HPLC) conectado, a través de una interfaz adecuada, a un espectrómetro de masas (MS). La principal ventaja de la HPLC/MS sobre GC/MS es que es capaz de analizar una gama mucho más amplia de componentes. Los compuestos que son térmicamente lábiles, exhiben una alta polaridad o tienen un alto peso molecular pueden analizarse utilizando HPLC / MS, incluso las proteínas pueden analizarse de forma rutinaria. Las soluciones derivadas de muestras de interés se inyectan en una columna de HPLC que comprende un tubo estrecho de acero inoxidable (generalmente de 150 mm de longitud y 2 mm de diámetro interno, o más pequeño) lleno de partículas finas de sílice modificadas químicamente. Los compuestos se separan en función de su interacción relativa con el recubrimiento químico de estas partículas (fase estacionaria) y la filtración de disolvente a través de la columna (fase móvil). Los componentes que salen de la columna cromatográfica se introducen en el espectrómetro de masas a través de una interfaz especializada. Las dos interfaces más comunes utilizadas para HPLC / MS son la ionización electrospray y las interfaces de ionización química a presión atmosférica.
Ionización por electrospray
En la ionización por electrospray, el analito se introduce en la fuente a velocidades de flujo típicamente del orden de 1µl min-1. El flujo de solución de analito pasa a través de la aguja electrospray que tiene una gran diferencia de potencial (con respecto al electrodo contrario) aplicada a ella (típicamente en el rango de 2,5 a 4 kV). Esto fuerza la pulverización de gotitas cargadas desde la aguja con una carga superficial de la misma polaridad a la carga en la aguja. Las gotas se repelen desde la aguja hacia el cono de muestreo de la fuente en el electrodo contrario (se muestra en azul). A medida que las gotas atraviesan el espacio entre la punta de la aguja y el cono, se produce la evaporación del disolvente. Esto está marcado en la figura.1 y ampliado en la Fig.2. A medida que ocurre la evaporación del solvente, la gota se encoge hasta que alcanza el punto en el que la tensión superficial ya no puede sostener la carga (el límite de Rayleigh), momento en el que se produce una «explosión coulombica» y la gota se rompe. Esto produce gotas más pequeñas que pueden repetir el proceso, así como moléculas de analito cargadas desnudas. Estas moléculas de analito cargadas (no son estrictamente iones) pueden cargarse de forma individual o multiplicada. Este es un método de ionización muy suave, ya que el analito retiene muy poca energía residual tras la ionización. Es la generación de moléculas con carga múltiple la que permite analizar componentes de alto peso molecular, como las proteínas, ya que el rango de masa del espectrómetro de masas aumenta considerablemente, ya que en realidad mide la relación masa / carga en lugar de la masa per se. La principal desventaja de la técnica es que se produce muy poca (generalmente ninguna) fragmentación, aunque esto se puede superar mediante el uso de técnicas de espectrometría de masas en tándem, como MS/MS o MSn.
Figura 1 Un esquema de una interfaz ESI
Figura 2 Un esquema del mecanismo de formación de iones
Ionización química a presión atmosférica
Química a presión atmosférica la ionización (APCI) es un método de ionización análogo a la ionización química (CI). La diferencia significativa es que el APCI se produce a presión atmosférica y tiene sus aplicaciones primarias en las áreas de ionización de compuestos de baja masa (APCI no es adecuado para el análisis de compuestos térmicamente lábiles). La configuración general de la fuente (ver Fig. 3) comparte un gran parecido con ESI. Cuando el APCI difiere del ESI, es en la forma en que se produce la ionización. En ESI, la ionización se compra a través de la diferencia de potencial entre la aguja de pulverización y el cono, junto con una desolvatación rápida pero suave. En APCI, la solución de analito se introduce en un nebulizador neumático y se desolvala en un tubo de cuarzo calentado antes de interactuar con la descarga de corona creando iones. La descarga de corona reemplaza el filamento electrónico en CI – la presión atmosférica «quemaría» rápidamente cualquier filamento-y produce N2°+ y N4°+ primarios por ionización de electrones. Estos iones primarios colisionan con las moléculas de disolvente vaporizadas para formar iones de gas reactivo secundario, por ejemplo, H3O+ y (H2O)nH+ (ver Fig. 4). Estos iones de gas reactivos luego sufren colisiones repetidas con el analito, lo que resulta en la formación de iones analitos. La alta frecuencia de colisiones da como resultado una alta eficiencia de ionización y termalización de los iones analitos. Esto da como resultado espectros de especies predominantemente moleculares e iones aductos con muy poca fragmentación. Una vez que los iones se forman, entran en la etapa de bombeo y enfoque en forma muy similar a la ESI.
Figura 3 Un esquema de los componentes de una fuente de APCI
Figura 4 Una vista más detallada del mecanismo de APCI
Diagramas y texto (parcial) por el Dr. Paul Gates, de Química, Universidad de Bristol