Su asesor le dice que quiere que use HPLC para analizar su compuesto. Sabes que has oído hablar de esta técnica antes, pero no puedes recordar lo que significa HPLC, ¡y mucho menos cómo hacerlo! Todos hemos estado allí, y apuesto a que desearías haber prestado más atención en esa conferencia.
No temas, en esta serie de artículos te recordaré el poder de la columna de HPLC 🙂
En este primer artículo, te guiaré por el principio detrás de la HPLC y te recordaré sus usos: ¡estarás listo para el laboratorio en poco tiempo!
¿Cómo funciona la HPLC?
La cromatografía líquida de alto rendimiento, o HPLC, es un nombre largo para una técnica poderosa basada en el simple hecho de que los compuestos individuales se comportan de manera diferente en el agua.
La HPLC separa y purifica los compuestos de acuerdo con su polaridad, o su tendencia a gustar o disgustar el agua. Para poner la polaridad en contexto, considere que el aceite es un líquido apolar que no se mezcla con el agua. El etanol, por otro lado, es polar y, como muchos de ustedes saben, se mezcla muy bien con agua (¿alguien quiere vodka y coca cola??).
He intentado simplificar todo el proceso en la Figura 1 a continuación, pero primero veamos los principales componentes involucrados en la CLAR. ¡Disculpas por adelantado por alguna jerga inevitable!
Los componentes
La columna de HPLC
Esto también se conoce como la fase estacionaria. Este es el caballo de batalla de la máquina de HPLC, está hecho de una variedad de sustancias (a menudo sílice) y es de naturaleza muy compacta. Las partículas de sílice son funcionalizadas por largas cadenas de carbono. Las cadenas de carbono son apolares y, por lo tanto, cuanto más larga es la cadena, más apolar se vuelve la columna. Las columnas que contienen cadenas de 18 carbonos se usan comúnmente y se conocen como columnas C18.
Los tipos de muestras de HPLC
varían mucho dependiendo del campo y del tipo de compuestos en cuestión. La HPLC se puede utilizar para analizar compuestos en muestras biológicas (orina, sangre, saliva y músculo), muestras ambientales, química medicinal (medicamentos) y microbiología (toxinas producidas por hongos y bacterias).
Inyección de muestras
Las muestras se inyectan en la columna de HPLC. Esto solía llevarse a cabo manualmente, lo que significaba que alguna pobre alma tenía que sentarse junto a la máquina de HPLC durante horas y horas inyectando cada muestra con una jeringa, ¡a veces toda la noche!
Afortunadamente, los modelos más nuevos tienen un inyector automático, lo que reduce la entrada manual y permite un mayor rendimiento. Las máquinas modernas están equipadas con software que permite al usuario ingresar una lista de muestras, cuánto y en qué orden deben inyectarse. Para que pueda disfrutar de su almuerzo mientras su HPLC funciona solo!
La fase móvil
Esto es realmente solo una mezcla de agua y un solvente orgánico (generalmente acetonitrilo o metanol). La fase móvil recibe su nombre porque se mueve a través de la columna y al mismo tiempo eluta (o elimina) los compuestos de la columna.
Los compuestos a menudo se eluyen a lo largo de un gradiente de concentración. Si eres como yo, concentración y gradiente son dos palabras que odias ver juntas en una oración. Solo significa que el porcentaje de agua en la fase móvil disminuye con el tiempo, mientras que el porcentaje del solvente apolar aumenta simultáneamente. Esto significa que la fase móvil se vuelve gradualmente más apolar. No te preocupes demasiado por los degradados por ahora, ya que volverán a aparecer en un artículo de seguimiento.
La ejecución de HPLC
HPLC se puede realizar en varios modos. El método más comúnmente utilizado se conoce como fase inversa (RP-HPLC) y esto es lo que describo aquí. En este modo, los compuestos se separan comenzando con los más polares y terminando con los compuestos apolares. Para todos los modos, una bomba de alta potencia mueve la muestra y la fase móvil a través de la columna. Una carrera típica puede tardar entre 10 y 60 minutos.
El principio detrás de la CLAR: un vistazo más de cerca
Ahora que tiene una idea de los componentes involucrados, pasemos al principio con un poco más de detalle.
Mencioné anteriormente que la HPLC separa los compuestos en función de la polaridad. Pero, ¿cómo funciona esto en realidad? En inglés, por favor! A medida que el gradiente se activa, la concentración de disolvente aumenta mientras que la concentración de agua disminuye. Esto hace que la fase móvil más y más apolar. Los compuestos contenidos en la muestra se pegarán a las cadenas de carbono en la columna, con los compuestos más apolares pegándose los más fuertes, y los compuestos más polares pegándose débilmente.
La figura 1 muestra lo que sucede con una muestra que contiene una mezcla de compuestos después de la inyección en la columna. Los compuestos se unen a la columna y se eliminan en diferentes momentos, dependiendo de si es más probable que se adhieran a la columna o a la fase móvil a medida que se bombea. El tiempo que cada compuesto eluta (o expulsa) de la columna se conoce como el tiempo de retención de ese compuesto (Rf).
Figura 1: El principio detrás de HPLC
Figura 1: Compuestos de polaridades diferentes (indicados como tonos de azul oscuro) se inyectan en la columna de HPLC (cilindro entero). La fase móvil se bombea a través de la columna, y la adición de disolvente a lo largo de un gradiente de concentración (que se muestra como una línea de puntos negra) disminuye continuamente la polaridad general de la fase móvil (eje Y). Los compuestos son capaces de adherirse a la columna o a la fase móvil, dependiendo de cuán polares sean. Los compuestos eventualmente se adhieren a la fase móvil cuando su polaridad coincide con la de la fase móvil. Luego se disociarán de la columna y se eluirán en un momento determinado (eje X) durante la carrera. Esta vez se conoce como el Rf para ese compuesto.
Comprensión de la salida
La salida o los resultados de una ejecución de HPLC generalmente se ven como un cromatograma (Figura 2). Esta es una serie horizontal de picos que representan compuestos eluidos de la columna con diferentes valores de Rf. Los equipos modernos de HPLC a menudo se acoplan a un detector de matriz de diodos (DAD), lo que permite al usuario observar el cromatograma resultante de compuestos separados en longitudes de onda de 190 nm a 900 nm. Si se conocen los compuestos bajo investigación, el usuario puede elegir mirar solo 1 o algunas longitudes de onda seleccionadas. Por ejemplo, la cocaína se puede observar a 254 nm.
Figura 2: Un cromatograma típico de HPLC
Figura 2: Este cromatograma muestra la separación de compuestos de una reacción química, y el cromatograma se ve a 254 nm. Dos picos principales ocurren a los 8,20 y 9 minutos, representando dos compuestos con estos tiempos de retención. El número de unidades de absorbancia (UA) se muestra en el eje Y, mientras que el tiempo de ejecución se muestra en el eje X.
Aplicaciones
Dentro de la biología y la medicina, la HPLC se utiliza a menudo como una herramienta analítica para analizar muestras biológicas y ambientales en busca de la presencia o ausencia de compuestos conocidos (por ejemplo, metabolitos, medicamentos, toxinas, pesticidas), y puede ayudar en la identificación de compuestos desconocidos.
Dentro de la química, sin embargo, la HPLC se usa rutinariamente para monitorear reacciones químicas, así como para determinar la pureza de los productos. Además, el proceso de HPLC se puede modificar a HPLC preparativo, por lo que los compuestos de interés se pueden purificar para su uso posterior.
La HPLC puede parecer muy complicada para empezar, pero tenga la seguridad de que, al igual que la mayoría de las otras técnicas de laboratorio, tiene mucho más sentido cuando realmente lo hace.
Manténgase atento a mis artículos de seguimiento en las próximas semanas, en los que analizaré algunos consejos sobre cómo puede obtener lo mejor de su carrera de HPLC en función de su objetivo de investigación, así como discutir objetivamente cómo se puede usar la HPLC dentro de su investigación.
¿Hay otros aspectos de esta técnica que le gustaría que se cubrieran con más detalle? Si es así, nos encantaría saber de usted!
Feliz HPLC-ing 🙂
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