Durante la etapa de translocación de la fase de elongación de la síntesis de proteínas, el ARNm es avanzado por un codón, acoplado al movimiento de los ARNt desde los sitios ribosómicos A (aminoacilo) a P (peptidilo) y P a E (salida), en un proceso catalizado por el factor de elongación EF-G (1). En primer lugar, los ARNt se mueven en la subunidad 50S hacia estados híbridos P/E y A/P, seguidos por el movimiento de los bucles madre de anticodones del ARNt (ASL) desde los sitios de la subunidad A y P de los años 30 hasta los sitios P y E, respectivamente, acoplados al movimiento de sus codones de ARNm asociados (2). El primer paso va acompañado de rotación de la intersubunidad (3-7), mientras que el segundo paso requiere EF-G·GTP, e implica la rotación del dominio de cabeza de subunidad 30S (8-11). Aunque recientemente se ha aprendido mucho sobre la base estructural del movimiento P-tRNA al sitio E(9, 10, 12, 13), los intermedios de translocación que contienen A-ARNt son más difíciles de atrapar. Por lo tanto, gran parte de nuestro pensamiento sobre la base estructural del movimiento de ARNm y ARNt A se ha basado en estructuras cristalinas de EF-G unidas a complejos ribosómicos vacíos (14) o que contienen ARNt-P atrapados en estados clásicos (15) o híbridos (10, 12, 13) y dos estructuras criomem de complejos ribosómicos-EF-G de 70S que contienen dos ARNt unidos en estados híbridos P/E y A/P* (16), o en estados híbridos quiméricos ap/P y pe/E (11).
Aquí reportamos la estructura cristalina de un intermediario de translocación de ribosomas de 70S que contiene EF-G, ARNm y dos ARNt: un ARNt desacilado unido en el estado pe/E y un ARNt peptidilo atrapado en un estado híbrido quimérico ap / ap. El complejo se formó con ribosomas T. thermophilus 70S, un ARNm de 39 nucleótidos, un alargador tRNAMet en el sitio P y N-acetil-Val-tRNAVal en el sitio A. Para atrapar el intermedio de translocación, agregamos neomicina para bloquear la finalización de la translocación y ácido fusídico para evitar la liberación de EF-G (Métodos suplementarios; Fig. S1). La estructura se resolvió utilizando datos de difracción a 3,8 Å obtenidos de un único cristal (Tabla S1). Ejemplos de densidad electrónica se muestran en materiales suplementarios (Figs. S2 a S13). En relación con el ribosoma de estado clásico (17), la cabeza de la subunidad 30S experimenta una gran rotación de 21° en sentido antihorario, y el cuerpo 30S una rotación de 2,7° en relación con la subunidad 50S (Fig. 1, Fig 2A, B). El bucle de vástago anticodon P-tRNA (ASL) se mueve con la cabeza 30S en una posición entre el sitio P de la cabeza 30S y el sitio E del cuerpo 30S (estado quimérico pe; Fig 1D, E), mientras que su extremo aceptor se mueve completamente en el sitio 50S E (Fig 1C), formando un estado híbrido quimérico pe/E (9-11). El A-tRNA ASL se mueve a ~4Å de los elementos del sitio P del cuerpo de los años 30 (Fig. 1D); su codo gira hacia el sitio clásico P de los años 50, pero su extremo aceptor está unido entre los sitios de la subunidad A y P de los años 50 (Fig. 1C), formando un estado híbrido quimérico ap/ap. La rotación grande, dependiente de EF-G de la cabeza 30S en nuestra estructura reposiciona la hélice H38 del ARNr 23S, permitiendo que el codo del ARNt A alcance la posición del codo del ARNt del sitio P (Fig. S14). El dominio IV de EF-G está encajado en el sitio de convergencia del codón de ARNm del sitio A, el bucle anticodon del ARNt ap/ap y los ARNR 16S y 23S en el puente de intersubunidad B2a, contactando simultáneamente los cuatro ARN (Fig. S15).
(A) ribosoma 70S con ARNt unidos en estados clásicos A/A y P/P (17); (B) Complejo intermedio de translocación, que muestra ARNt atrapados en estados híbridos quiméricos intermedios ap/ap y pe/E. (C) Comparación de posiciones de ARNt en estados clásicos y en el intermedio de translocación, alineado en la subunidad 50S; (D) posiciones relativas de los ARNt ASL, alineados en el cuerpo de la subunidad 30S o (E) cabeza. Los componentes moleculares están coloreados en todas partes como: ARNr 16S, cian; proteínas 30S, azul; ARNr 23S, gris; ARNr 5S, azul claro; proteínas 50S, magenta; ARNm, verde; ARNt A/A y ap/ap, amarillo; ARNt P/P y pe/E, rojo; EF-G, naranja.
(A–B) Posiciones de ARNt en el ribosoma de estado clásico y (B) intermedio de translocación. (C–D) Interacciones de los ASL de ARNt y ARNm a medida que se mueven de los estados clásicos (C) A y P a los estados híbridos quiméricos (D) ap y pe. (E–F) El reordenamiento del bucle 966 (h31) del ARNr 16S en la cabeza de la subunidad 30S desde su posición clásica de unión de ARNt-P a (F) forma un bolsillo de ajuste de superficie alrededor de la ASL de ARNt ap/ap.
Aunque la rotación de la cabeza de 30 S facilita claramente la translocación del ASL del sitio P (9-11), el ASL del sitio A se translocaliza por un mecanismo diferente. El ASL del sitio P se mueve con precisión con la rotación de la cabeza 30S hacia el estado pe/E, mientras que el ASL del sitio A se ha movido más allá del movimiento de rotación de la cabeza hacia el estado ap en la subunidad 30S (Fig. 1E). El movimiento del ASL del sitio A con precisión de rotación de la cabeza resultaría en un choque severo con el dominio IV de EF-G tal como está posicionado en nuestro complejo, lo que, junto con el contacto formado entre la punta del dominio IV y la hélice codón-anticodón del ARNt ap/ap (Fig. S16), sugiere que el movimiento del ARNm y el ASL están acoplados al del dominio IV.El desplazamiento adicional del ASL ap/ap lo acerca al ASL pe/E (Fig. 2C, D) (11). La posición de la cabeza puede estabilizarse por interacción entre el fosfato 1210 de 16S rRNA con el dominio IV de EF-G en Gly531.
Lo más llamativo es el reordenamiento del bucle 16S rRNA 966 en la cabeza 30S, que se separa del sitio P para alcanzar el sitio A, donde inicia el contacto con el ap / ap-ASL parcialmente translocado (Fig. 2E, F). Este reordenamiento implica la interrupción del empaquetamiento de m22G966 contra la ribosa 34 del sitio P ASL (18, 19), y la formación de un bolsillo de ajuste de superficie alrededor del ap/ap-ASL por los nucleótidos A965, m22G966 y C1400. En una estructura cristalina del complejo monotrn correspondiente (10) (Fig. S6), se encontró que el ASL de tRNA pe/E mantenía todos los contactos canónicos del sitio P con la cabeza 30S, incluido el bucle 966, a medida que gira hacia el sitio E. Sin embargo, en el complejo de dos ARNt descrito aquí, solo se mantiene un subconjunto de interacciones de la cabeza del sitio P 30S con el ASL de pe/E, que involucra a G1338, A1339, A1340 y la cola C-terminal de la proteína uS9. La formación de interacciones post-translocación simultáneamente con la interrupción de las interacciones pre-translocación, sugiere un mecanismo para cómo se transmiten los ASL entre los sitios A y P. También puede representar un cambio inicial en los contactos que debe interrumpirse para liberar el ASL del ARNt pe/E antes de la rotación posterior de la cabeza 30S en las etapas finales de la translocación (20, 21).
La red de interacciones formada entre el bucle 1 conservado (residuos 499-504) en el dominio IV de EF-G, el LSA ap/ap y su codón de ARNm (Fig. S15) (11) son similares a los observados en el estado post-translocación (15), lo que sugiere que se mantienen a lo largo del ciclo de translocación. Su parecido con las interacciones de ranura menor realizadas por A1492 y A1493 con la hélice codón-anticodón en el sitio de decodificación (22) sugiere que pueden ayudar a mantener el emparejamiento correcto codón-anticodón durante el movimiento entre los sitios A y P (15), y son consistentes con la propuesta de que EF-G facilita la translocación mediante interacciones desestabilizadoras en el sitio de decodificación de los años 30 (23).
Se han propuesto interacciones entre el ARNm y elementos de la cabeza 30S dentro del túnel de entrada de ARNm aguas abajo para llevar el ARNm hacia adelante con el ARNt durante la rotación de la cabeza (17). Sin embargo, no está claro que el movimiento neto del ARNm pueda sostenerse de esta manera, porque estas interacciones se interrumpen durante la rotación de la cabeza. Encontramos que la cola extendida del ARNm, a medida que emerge del túnel aguas abajo, se curva hacia arriba para unirse a la superficie de la proteína uS3 en la cabeza de la subunidad (Fig. 3, S17). Por lo tanto, la rotación de la cabeza hacia adelante movería activamente el ARNm en la dirección de la translocación. La comparación de la posición de un nucleótido de referencia en el ARNm en los estados girado y no girado muestra además que la rotación de la cabeza hacia adelante haría avanzar el ARNm en un codón (Fig. 3D), apoyando la posibilidad de que el ARNm sea movido activamente por el ribosoma durante la translocación. Dado que las dimensiones del túnel aguas abajo excluyen la entrada de una hélice de ARN, la interrupción de la estructura secundaria de ARNm por la helicasa ribosómica (24) debe ocurrir en o cerca de la entrada al túnel, por interacción con el ribosoma fuera del túnel. La unión de la cola del ARNm que flanquea inmediatamente la entrada al túnel exclusivamente a la cabeza de los años 30 proporciona dicha interacción. Las fuerzas creadas por la rotación de la cabeza podrían desestabilizar el emparejamiento de bases en elementos helicoidales de ARNm a medida que ingresan al túnel aguas abajo.
(A) La entrada al túnel de entrada del ARNm aguas abajo está rodeada por las proteínas uS3, uS4 y uS5. Las posiciones +14 a + 21 entran en contacto con un parche cargado positivamente en la superficie de la proteína uS3 en la cabeza 30S (Fig. S17). B) Trayectoria del ARNm aguas abajo y C) visión girada a 90°. (D) El acoplamiento en el cuerpo de los años 30 de la estructura clásica (17) (gris) muestra que la rotación de la cabeza en la estructura intermedia ap/ap traslada el ARNm por un codón. Codón A (amarillo) y codón P (rojo).
En el estado clásico, C74 y C75 en la cola CCA del ARNt del sitio P forman pares de bases con G2252 y G2251, respectivamente, en el bucle P (H80) del ARNr 23S, mientras que C75 del ARNt del sitio A se empareja con G2553 en el bucle A (H92) (18, 25, 26). Estas interacciones posición de la peptidil y aminoacil restos de la peptidil transferasa reacción (27), lo que deja un tRNA desacilada en el sitio P, y una peptidil tRNA en el sitio. Un paso crítico en la translocación es, por lo tanto, el movimiento posterior del extremo peptidil-CCA del bucle A al bucle P. La estructura del intermedio de translocación revela un estado quimérico, distinto de los descritos anteriormente (Fig. S18), en el que el extremo aceptor del ARNt-peptidilo interactúa simultáneamente con los bucles A y P (Fig.4). En este estado, el emparejamiento de base de C75 con G2553 del bucle A se conserva, mientras que el movimiento de su vástago aceptor en una posición cercana a la del ARNt clásico del sitio P permite que G2252 y G2253 en un bucle P reorganizado entren en contacto con la columna vertebral del ARNt en las posiciones 72 y 70 (Fig. 4B). Por lo tanto, el extremo del vástago aceptor del ap/ap-tRNA está anclado en el bucle P, facilitando la transferencia de sus residuos C74 y C75 adyacentes desde el bucle A al bucle P. A76 del ARNt ap/ap está orientado de manera similar a la observada para el ARNt unido en el estado clásico P/P (17), con su fracción peptidil N-acetil-valina posicionada en la entrada del túnel de salida del péptido, mientras que C74 y C75 mantienen sus interacciones con el bucle A de ARNr 23S (Figs. 4, S19).
Durante la translocación, el extremo aceptor de 3′ de peptidil-tRNA se mueve desde el estado (A) clásico A/A al estado (B) intermedio ap/ap a los estados (C) clásicos P/P, facilitado por cambios conformacionales en los bucles A y P.
El ap/ap-arnt puede corresponder a los estados intermedios, que se han caracterizado cinéticamente. Los estudios cinéticos de atenuación de fluorescencia identificaron un intermediario dependiente de FE-G (INT) en el que el codo peptidil-ARNt se mueve desde el sitio A hacia el sitio P, pero permanece solo parcialmente reactivo con el aminoacil-ARNt que imita la puromicina, lo que sugiere que su extremo de CCA no está completamente acomodado en el sitio P (28). Los estudios cinéticos en los que se conectó una sonda directamente al extremo CCA del ARNt-peptidilo, identificaron intermediarios de translocación dependientes de FE-G en los que el extremo aceptor del ARNt-peptidilo se mueve hacia el sitio P, pero permanece sin reacción de puromicina (29). Las propiedades de estos intermedios son compatibles con el estado ap/ap atrapado observado aquí. La estructura de este intermedio de translocación atrapado comienza a describir cómo el ARNt se mueve entre los sitios ribosómicos A y P. Los sitios de enlace del ARNt en sí son dinámicos, formando contactos simultáneos entre el ARNt A y los elementos de los sitios A y P, asemejándose al paso del testigo en una carrera de relevos (30). Esto se ve tanto para las subunidades 30 y 50. En la subunidad 30S, el reordenamiento del bucle 966 del ARNr 16S libera G966 del LSA del sitio P para ponerse en contacto con el LSA del sitio A a medida que se mueve hacia el sitio P 30S (Fig. 2E, F). En la subunidad 50S, los bucles A y P del ARNr de 23S se reorganizan para permitir que ambos bucles entren en contacto con el extremo aceptor de 3’del ARNt del sitio A al comenzar su transición al sitio P de 50S (Fig. 4). Estos hallazgos muestran que la dinámica estructural del ARN ribosómico juega un papel activo en el mecanismo de translocación.