Robert De Niro Sr. nació en Siracusa, Nueva York, de madre irlandesa-estadounidense, Helen M. (nacida O’Reilly; 1899-1999). La madre de Helen era Mary E. Burns (hija de John y Mary Burns) y su padre era Dennis Francis O’Reilly, hijo de Ellen Hall de Dundrum, la segunda esposa de Edward O’Reilly. Hubo confusión previa sobre la maternidad de Dennis, su madre se creía que era la segunda esposa de Edward, Margaret.El padre italo-americano de Robert, Henry Martin De Niro (1897-1976), nació de padres que emigraron de Ferrazzano en 1887, Angelina Mercurio y Giovanni Di Niro.
Robert era el mayor de tres hijos; él y sus hermanos John y Joan se criaron en Siracusa, Nueva York. De Niro estudió en el famoso Black Mountain College con Josef Albers de 1939 a 1940. Si bien el enfoque altamente analítico de Albers a la pintura no apelaba al estilo más instintivo de De Niro, la experiencia y la perspectiva internacional del maestro de la Bauhaus dejaron una impresión duradera. De Niro estudió con Hans Hofmann en su escuela de verano de Provincetown, Massachusetts. La enseñanza de Hofmann sobre el Expresionismo Abstracto y el formalismo cubista tuvo una fuerte influencia en el desarrollo de De Niro como artista maduro.
En la escuela de verano de Hofmann, conoció a su compañera de estudios Virginia Admiral, con quien se casó en 1942. La pareja se mudó a un loft grande y espacioso en Greenwich Village de Nueva York, donde pudieron pintar. Se rodearon de un ilustre círculo de amigos, incluidos los escritores Anaïs Nin y Henry Miller, el dramaturgo Tennessee Williams y la actriz y famosa bailarina berlinesa Valeska Gert. Admiral y De Niro se separaron poco después de que su hijo Robert De Niro Jr. naciera en agosto de 1943, después de que De Niro se declarara gay. En 1944, De Niro tuvo una relación con el poeta Robert Duncan.
Después de estudiar con Hans Hofmann en Nueva York y Provincetown y Josef Albers en el Black Mountain College, Carolina del Norte a finales de la década de 1930 y principios de la década de 1940, De Niro trabajó durante cinco años en el legendario Museo de Arte No Objetivo de Hilla Rebay. En 1945, fue incluido en una exposición colectiva en el Arte de este Siglo de Peggy Guggenheim en Nueva York, que fue una galería líder para el arte de modernistas europeos establecidos y miembros del emergente grupo Expresionista Abstracto como Jackson Pollock, Mark Rothko, Robert Motherwell y Clyfford Still. De Niro tuvo su primera exposición individual en la galería Guggenheim en abril y mayo del año siguiente. En ese momento, estaba trabajando principalmente de manera abstracta, a menudo con referencias figurativas. Gran parte de su trabajo de este período se perdió en un incendio en un estudio en 1949.
De Niro tuvo una serie de exposiciones individuales en la década de 1950 en la Galería Charles Egan de Nueva York, que exhibió el trabajo de Willem de Kooning y otros primeros artistas expresionistas abstractos. Los críticos elogiaron las composiciones de DeNiro llenas de áreas improvisadas de colores vibrantes que dieron paso a naturalezas muertas pintadas vagamente y desnudos curvilíneos. A mediados de la década de 1950, De Niro fue incluido regularmente en importantes exposiciones colectivas como el Whitney Annual, el Stable Annual y el Museo Judío. Fue galardonado con un premio de la Fundación Longview en 1958.
De 1961 a 1964, De Niro viajó a Francia para pintar en París y en los alrededores. El coleccionista Joseph Hirshhorn compró una serie de pinturas y obras sobre papel del artista durante este período a través de la galerista de De Niro, Virginia Zabriskie, que ahora se encuentran en la colección permanente del Museo y Jardín de Esculturas Hirshhorn en Washington, DC. En 1968, recibió una beca Guggenheim.